Если прямая проба кумбса сомнительная что делать. Методика определения групп крови

Проба Кумбса является методом лабораторного исследования, сделанного путем воздействия на гемагглютинацию. В ее основании лежит восприимчивость антител к иммуноглобулинам и элементам фермента, а также их способность агглютинировать эритроциты, покрытые C3 либо Lg.

Прямая диагностика Кумбса

Используется для обнаружения антител или составляющих комплемента, установленных с наружной части клеток. Прямая проба Кумбса выполняется следующими действиями.

Применение такой пробы

Прямую диагностику Кумбса используют в определенных случаях, таких, как:

трансфузионные воздействия;
аутоиммунный гемолиз;
медикаментозная гемолитическая анемия.

Непрямая проба Кумбса

Данная диагностика дает возможность выявить антитела к клеткам в сыворотке, которую инкубируют, как правило, с донорскими эритроцитами типа 0, а потом осуществляют прямую пробу. Применяют непрямую диагностику Кумбса в следующих случаях:

Как готовиться к анализу

Существуют некоторые правила подготовки к обследованию.

Если пациент является новорожденным, родителям нужно знать, что исследование будет способствовать диагностированию ГЗН (гемолитическому заболеванию новорожденных).
В случае если у больного есть подозрения гемолитического малокровия, ему должны объяснить, что анализ позволит узнать, вызвано ли оно защитными расстройствами, приемами лекарств либо другими факторами.
Проба Кумбса прямая и непрямая не делает никаких ограничений в режиме питания или диете.
Необходимо уведомить пациента, что для обследования потребуется взять кровь из вены, а также сказать ему, когда именно будет производиться венепункция.
Еще следует предупредить о вероятности неприятных ощущений в период наложения повязки на руку и самой процедуры.
Препараты, которые способны подействовать на результат образца, нужно отменить.

К таким лекарствам относятся:

«Стрептомицин»;
«Метилдофа»;
«Прокаинамид»;
сульфаниламиды;
«Мелфалан»;
«Хинидин»;
«Рифампин»;
«Изониазид»;
цефалоспорины;
«Гидралазин»;
«Хлорпромазин»;
«Леводопа»;
«Тетрациклин»;
«Дифенилгидантоин»;
«Этосуксимид»;
«Пенициллин»;
мефенаминовая кислота.

Забор крови совершают с утра натощак.

Как проводится мероприятие

Проба Кумбса осуществляется в таком порядке:

При выполнении диагностики у взрослого больного после венепункции берут кровь в трубочки с ЭДТА (этилендиаминтетраацетатом).
У новорожденного производят забор крови из пуповины в мензурку с ЭДТА.
Зону прокола прижимают ватным тампоном до прекращения кровотечения.
При появлении синяка в месте венепункции прописывают согревающие компрессы.
После набора крови пациенту разрешается вернуться к приему отменных препаратов.
Необходимо сообщить родителям новорожденного, что для наблюдения за динамикой анемии может потребоваться вторичный анализ.

Преимущества пробы Кумбса

Такое исследование имеет некоторые превосходства, а именно:

Минусы анализа

Проба Кумбса положительная является достаточно трудоемким методом осмотра, предполагающим характерную точность выполнения. При ее использовании можно столкнуться с определенными трудностями, связанными в особенности с интерпретацией слабоположительных воздействий.

Установлено, что ошибочные отрицательные либо слабоположительные реакции при производстве проб Кумбса могут стать последствиями неудовлетворительно активной отмывки клеток, ослабления антиглобулинового реагента остатками сыворотки, а также соединения с необезжиренной наружностью, на которой может закрепляться антиглобулин, утрачивая при этом свою действенность.

Проба Кумбса отличается еще одним недостатком - малостойкостью антиглобулинового реагента, приобретение и сохранение которого имеют индивидуальные особенности, что аналогично делает сложной численную оценку воздействия антиглобулиновой сыворотки на гемагглютинацию.

Болезни, которые можно обнаружить при исследовании

Диагностика Кумбса дает возможность обнаружить некоторые виды заболеваний, такие, как:

гемолитическое недомогание новорожденных;
различные трансфузионные реакции;
аутоиммунный гемолиз;
лекарственное гемолитическое малокровие.

На сегодняшний день проба Кумбса считается довольно популярной системой исследования крови как у взрослого человека, так и у новорожденного. Она дает возможность выявить множество различных болезней.

Прямая проба Кумбса (прямой антиглобулиновый тест) - это лабораторный тест, который выявляет антиэритроцитарные антитела, фиксированные на эритроцитах.

Показания к исследованию

Какие показания к исследованию: установление иммунной природы гемолитической анемии.

Подготовка к исследованию

Как подготовиться к исследованию:

1. Если пациент — новорожденный, родителям следует объяснить, что исследование поможет диагностировать ГБН (гемолитическую болезнь новорожденных).

2. Если у пациента подозревают гемолитическую анемию, ему следует объяснить, что исследование позволит выяснить, обусловлена ли она иммунными нарушениями, приемом препаратов или другими причинами.

3. Каких-либо ограничений в диете или режиме питания не требуется.

4. Следует предупредить пациента (или родителей новорожденного), что для исследования понадобится взять кровь из вены, и сообщить ему, кто и когда будет делать венепункцию.

5. Следует предупредить о возможности неприятных ощущений во время наложения жгута на руку и венепункции.

6. Препараты, которые могут повлиять на результат пробы, следует отменить. К ним относятся хинидин, метилдофа, цефалоспорины, сульфаниламиды, хлорпромазин, дифенилгидантоин, этосуксимид, гидралазин, леводопа, мефенаминовая кислота, мелфалан, пенициллин, прокаинамид, рифампин, стрептомицин, тетрациклины, изониазид.

Забор крови осуществляют в утренние часы натощак.

Материал для анализа

Материал для анализа:

Проведение процедуры

Как проходит процедура забора крови:

1. При проведении пробы у взрослого пациента после венепункции набирают кровь в пробирки с ЭДТА.

2. У новорожденных берут кровь из пуповины в пробирку с ЭДТА.

3. Место венепункции придавливают ватным шариком до остановки кровотечения.

4. При образовании гематомы в месте венепункции назначают согревающие компрессы.

5. После взятия крови пациент может возобновить прием отмененных препаратов.

6. Следует предупредить родителей новорожденного, что для контроля за динамикой анемии, возможно, потребуется повторное исследование.

Метод проведения прямой пробы Кумбса:

Она проводится следующим образом:

Для получения антител к человеческим иммуноглобулинам (антиглобулиновой сыворотки) или комплементу (антикомплементарной сыворотки) животное иммунизируют человеческой сывороткой, иммуноглобулинами или комплементом человека. Полученную от животного сыворотку очищают от антител к другим белкам.

Эритроциты больного отмывают физиологическим раствором для полного удаления сыворотки, которая нейтрализует антитела к иммуноглобулинам и комплементу и может стать причиной ложноотрицательного результата.

Если на поверхности эритроцитов фиксированы антитела или компоненты комплемента, добавление антиглобулиновой или антикомплементарной сыворотки вызывает агглютинацию эритроцитов.

Преимущества и недостатки

Какие преимущества и недостатки прямой пробы Кумбса:

Преимущества исследования: высокая чувствительность, значительно превосходящая разрешающую способность альтернативных методов исследования, которые используются для выявления неагглютинирующих антител.

Недостатки исследования:

Прямая проба Кумбса - трудоемкий метод исследования, требующий особой тщательности в выполнении. При ее использовании встречаются некоторые затруднения, связанные, в частности, с интерпретацией слабоположительных реакций. Известно, что ложные слабоположительные или отрицательные реакции при выполнении проб Кумбса могут быть следствием недостаточно эффективной отмывки эритроцитов, нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки, а также контакта с необезжиренной поверхностью, на которой может фиксироваться антиглобулин, теряя при этом свою активность.

Еще один недостаток пробы Кумбса — нестойкость антиглобулинового реагента, получение и хранение которого имеют определенные особенности, что также делает затруднительной количественную оценку реакции гемагглютинации с антиглобулиновой сывороткой.

Факторы, влияющие на результат исследования

Какие факторы могут повлиять на результат исследования:

1. Гемолиз, обусловленный неосторожным обращением с пробой крови.

2. Ацетаминофен, p-салициловая кислота, аминопирин, антигистаминные препараты, карбромал, цефалоспорины, хлорированные углеводные инсектициды, хлорпромазин, хлорпропрамид, цисплатин, клонидин, дипирон, этосуксимид, фенфлюрамин, фуадин, гидралазин, гидрохлортиазид, ибупрофен, инсулин, изониазид, леводофа, мефенаминовая кислота, мелфалан, метадон, метилдофа, метилсергид, номифензин, пеницилламин, пенициллины, фенацетин, фенилбутазон, пробенецид, прокаинамид, хинидин, хинин, рифампин, стрептомицин, сульфонамиды, производные сульфонилмочевины, тетрациклин, триамтерен, тримеллитиновый ангидрид.

В норме антитела к эритроцитам в крови отсутствуют.

Прямая проба Кумбса - антиглобулиновый тест (агглютинация в геле, позволяет выявить полные двухвалентные антитела), с помощью которого определяют антитела класса IgG и С3-компонент комплемента на поверхности эритроцитов. Обычно антитела, выявляемые прямой пробой Кумбса, имеют широкую специфичность, не ассоциированную с хорошо установленным антигеном. Положительная прямая проба Кумбса чётко указывает на наличие у больного гемолитической анемии, хотя не все больные с положительным прямым антиглобулиновым тестом страдают этим заболеванием. Приблизительно у 10% больных антитела или компоненты комплемента на мембране эритроцитов не удаётся определить прямой пробой Кумбса (тест отрицательный), но тем не менее они страдают аутоиммунной гемолитической анемией. Для уточнения специфичности антител в таких случаях используют тесты с их элюцией. Прямая проба Кумбса, положительная только к комплементу, обычно имеет отношение к холодовым антителам типа IgM. В этом случае антитела IgM не присутствуют на эритроцитах при базальной температуре тела. Однако вследствие того, что антитела IgM активно фиксируют комплемент, и комплемент остаётся на эритроцитах, при данной форме аутоиммунной гемолитической анемии (болезнь холодовых аггютининов) проба Кумбса будет положительна только к комплементу.

Прямая проба Кумбса положительна при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой тепловыми антителами, аутоиммунной лекарственной анемии (при приёме метилдофа до 20% больных имеют положительную реакцию), лекарственно-адсорбционном типе гемолитической анемии, иммунокомплексном типе гемолитической анемии (проба положительна только по отношению С3), при аутоиммунной гемолитической анемии, вызываемой холодовыми антителами - болезни холодовых агглютининов (проба положительна только по отношению С3). При пароксизмальной холодовой гемоглобинурии прямая проба Кумбса отрицательная.

Непрямая проба Кумбса - непрямой антиглобулиновый тест (обнаруживает неполные антитела) позволяет выявить атипичные антитела в крови, в том числе аллоантитела, к чужим антигенам эритроцитов. Свое название (непрямая) она получила вследствие того, что протекает в 2 этапа. Первоначально сыворотка крови больного, содержащая неполные антитела, взаимодействует с добавленным корпускулярным Аг-диагностикумом без видимых проявлений. На втором этапе внесённая антиглобулиновая сыворотка взаимодействует с неполными антителами, адсорбированными на антигенах, с появлением видимого осадка. Переливание гомологичных (аллогенных) эритроцитов или беременность - наиболее частые причины образования этих антиэритроцитарных антител. Сочетание положительной непрямой пробы Кумбса с отрицательной прямой пробой ничего не даёт для диагностики аутоиммунной гемолитической анемии. Положительная непрямая проба Кумбса вызывает определённые трудности при подборе крови для переливания и проведении перекрёстной пробы на совместимость с консервированной кровью, но не имеет другого диагностического значения.

На тарелку или предметное стекло наносятся пипетками (разными!) по 1-й крупной капле сыворотки О(I), А(II), В(III). Заметив время, чистой стеклянной палочкой или чистым углом предметного стекла капли сывороток соединяются с каплями крови. Определение длится 5 минут, покачивая тарелку, затем к каждой смеси капель добавляют по 1-й капле физраствора и оценивают результаты. Лучше, если сыворотка будет 2-х различных серий. Результаты групп крови должны совпадать в обеих сериях сыворотки.

Оценка результатов изогемагглютинации:

изогемагглютинация. При положительной реакции в смеси появляются мельчайшие красные зернышки склеивающихся эритроцитов. Зернышки сливаются в более крупные зерна, а последние в хлопья. Сыворотка почти обесцвечивается;

при отрицательной реакции смесь в течение 5 мин остается равномерно окрашенной в розовый цвет и никаких зернышек не обнаруживается;

при работе с 3-я сыворотками групп О(I), А(II), В(III) возможны 4 комбинации реакций:

если все 3 сыворотки дали отрицательную реакцию, то есть смесь равномерно окрашена в розовый цвет - это О(I) группа крови;
если отрицательную реакцию дала только сыворотка группы А(II), а сыворотки О(I) и В(III) дали положительную реакцию, то есть появились зерна - это А(II) группа крови;
сыворотка группы В(II) дала отрицательную реакцию, а сыворотки группы О(I) и А(II) дали положительную - это В(III) группа крови.

все 3 сыворотки дали положительные реакции - испытуемая кровь АВ(IV) группы. В этом случае проводится исследование с сывороткой АВ(IV) группы.

Обратите внимание! Капли исследуемой крови должны быть в 5-10 раз меньше капель сыворотки.

Ошибки изогемагглютинации.

Невыполнение агглютинации, где она должна быть и наличие агглютинации, где ее быть не должно. Это может быть при слабом титре сыворотки плюс плохая агглютинация эритроцитов.

Наличие агглютинации, где ее быть не должно - это псевдоагглютинация, когда кучки эритроцитов образуют "монетные столбики". Покачивание тарелки или добавление физраствора их разрушают.

Панагглютинация, когда сыворотка склеивает все эритроциты, в то числе и своей группы крови. К 5-й минуте признаки агглютинации исчезают.

Имеется еще так называемая холодовая панагглютинация, когда склеивание эритроцитов происходит из-за низкой температуры воздуха (ниже 15 °С) в помещении.

Во всех этих случаях проводят либо повторную реакцию, либо по стандартным эритроцитам.

Определение резус-принадлежности крови

Для определения резус-принадлежности, т. е. выявления в крови людей наличия или отсутствия антигенов системы резус используют стандартные сыворотки (реагенты) анти-резус, различные по специфичности, т. е. содержащие антитела по отношению к различным антигенам этой системы. Для определения антигена Rh 0 (D) чаще всего применяют сыворотку антирезус с добавлением 10% раствора желатина или используют стандартный реагент анти-резус, приготовленный заранее с 33% раствором полиглюкина. Для получения более точных результатов исследования, а также для выявления антигенов других серологических систем используют пробу Кумбса (она очень чувствительна также при определении совместимости переливаемой крови). Для исследования используют кровь нативную или приготовленную с каким-либо консервантом. В этом случае кровь следует отмывать от консерванта десятикратным объемом изотонического раствора хлорида натрия.При определении резус-принадлежности - Rh 0 (D) следует применять два образца сыворотки или реагента анти-резус двух различных серий и одновременно использовать для контроля стандартные эритроциты, полученные из крови от резус-положительных (Rh +) и резус-отрицательных (Rh -) лиц. При определении других изоантигенов должны соответственно применяться контрольные эритроциты, в которых содержится или отсутствует тот антиген, против которого направлены антитела в стандартной сыворотке.

Неполные тепловые агглютинины являются наиболее частой разновидностью антител, способных вызывать развитие аутоиммунных гемолитических анемий. Эти антитела относятся к IgG, редко - к IgM, IgA.

ПРОБА КУМБСА

Проба Кумбса: введение. Проба Кумбса - метод лабораторной диагностики, основанный на реакции гемагглютинации.

Основной метод диагностики аутоиммунных гемолитических анемий - проба Кумбса. В основе ее лежит способность антител, специфичных к иммуноглобулинам (особенно к IgG) или компонентам комплемента (особенно СЗ), агглютинировать эритроциты, покрытые IgG или СЗ.

Связывание IgG и СЗЬ с эритроцитами наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии и лекарственной иммунной гемолитической анемии. Прямая проба Кумбса. Прямая проба Кумбса применяется для выявления антител или компонентов комплемента, фиксированных на поверхности эритроцитов. Она проводится следующим образом:

Прямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях:

Аутоиммунный гемолиз.

Гемолитическая болезнь новорожденных.

Лекарственная иммунная гемолитическая анемия.

Гемолитические трансфузионные реакции. Непрямая проба Кумбса. Непрямая проба Кумбса позволяет обнаружить антитела к эритроцитам в сыворотке. Для этого сыворотку больного инкубируют с донорскими эритроцитами группы 0, а затем проводят прямую пробу Кумбса.

Непрямую пробу Кумбса применяют в следующих случаях:

Определение индивидуальной совместимости крови донора и реципиента.

Выявление аллоантител, включая антитела, вызывающие гемолитические трансфузионные реакции.

Определение поверхностных эритроцитарных антигенов в медицинской генетике и судебной медицине.

Подтверждение однояйцовости близнецов при трансплантации костного мозга.

Для проведения биологической пробы кровь начинают переливать по возможности быстро (желательно струйно). После переливания 25 мл крови трубка системы пережимается зажимом. Затем делается пауза на 3 мин, во время которой ведется наблюдение за состоянием реципиента. Для постановки биологической пробы кровь по 25 мл вводится трижды. По окончании пробы (после переливания первых 75 мл крови дробными дозами по 25 мл с интервалами 3 мин) система регулируется на необходимую скорость переливания. При переливании больному более одного флакона крови необходимости извлекать иглу из вены. В этом случае из пробирки флакона, в котором кончилась кровь, игла извлекается и вводится в следующий флакон. Трубка системы (резиновая или пластмассовая) пережимается в этот момент зажимом. Если во время переливания крови возникает необходимость внутривенного введения реципиенту какого-либо другого препарата, это осуществляют путем прокалывания резиновой трубки системы. Проколы пластикатовой трубки недопустимы, так как они не спадаются. После каждой гемотрансфузии за больным необходимо наблюдение для выявления и своевременного устранения возможных осложнений, в том числе аллергических реакций. Через 2 часа после окончания гемотрансфузии следует измерить температуру тела. При повышении ее измерение необходимо повторять в последующие 4 часа через каждый час. Не меньшее значение имеет наблюдение за мочеотделением и составом мочи, которое дает возможность установить наличие токсической посттрансфузионной реакции. Наступление олигурии и анурии после переливания крови, наличие в моче форменных элементов крови и белка являются прямым указанием на развитие посттрансфузионного гемолиза.

Утверждено приказом Росздравнадзора

по применению «Набора реагентов для определения антигенов и антител системы Резус крови человека»
(АГС для пробы Кумбса)

ТУ 9398-102-51203590-2012

РУ № РЗН 2013/1255 от 11.10.2013

I. ВВЕДЕНИЕ

Стандартная сыворотка для пробы Кумбса содержит специфические гетероиммунные антитела против белка крови человека и предназначена для использования в двух вариантах реакции – прямой и непрямой пробе Кумбса.

Прямая проба Кумбса применяется для определения сенсибилизации эритроцитов in vivo при гемолитической болезни новорожденнных и у больных с аутоиммунной формой хронической гемолитической анемии а также при некоторых других состояниях. Проведение прямой пробы Кумбса заключается в том, что к исследуемым эритроцитам, предварительно отмытым от белков собственной плазмы, добавляется сыворотка для пробы Кумбса. Если эритроциты были сенсибилизированы in vivo, то в результате реакции происходит их агглютинация.

Непрямая проба Кумбса применяется как проба для выявления состояния сенсибилизации организма, позволяющая выявлять антитела, находящиеся в свободном состоянии в сыворотке крови исследуемого лица; как проба на совместимость переливаемой крови, когда исследуется воздействие сыворотки реципиента на эритроциты предполагаемого донора; и как проба для определения различных групповых антигенов в эритроцитах при помощи предварительного воздействия на них стандартных сывороток, содержащих антитела заведомо известной специфичности. Непрямая проба Кумбса (все варианты) производится в два этапа, первым из которых является инкубация исследуемой (или стандартной) сыворотки со стандартными (или исследуемыми) эритроцитами, т. е. сенсибизация эритроцитов in vitro. Второй этап – собственно реакция с сывороткой для пробы Кумбса, которая производится так же, как прямая проба Кумбса.

Конечный результат реакции как в прямой, так и в непрямой пробе Кумбса происходит за счет взаимодействия стандартной сыворотки для пробы Кумбса, с антителами (белком крови человека), фиксированными на эритроцитах. Этот результат проявляется в виде агглютинации эритроцитов. Для наблюдения за агглютинацией следует использовать белую фарфоровую или любую белую пластинку обязательно со смачиваемой поверхностью для того, чтобы наносимые на нее капли хорошо размешивались и не растекались по поверхности пластинки. Перемешанные капли следует слегка размазать по пластинке, приблизительно до размера 2-х копеечной монеты.
II. ПОДГОТОВКА ИНГРЕДИЕНТОВ РЕАКЦИИ

Исследуемую сыворотку для определения в ней наличия и специфичности антител получают из крови обследуемого лица без добавления консерванта. Хранят при температуре + 4–8 0 С не более 2 суток или в замороженном состоянии – срок 1 месяц.

Сыворотку для пробы на совместимость получают таким же способом, но используют со сроком хранения не более 2 суток.

Эритроциты, предназначенные для определения в них тех или иных изоантигенов, заготавливаются с каким-либо консервантом от лица, кровь которого исследуется. Можно также использовать осадок эритроцитов из крови, взятой без консерванта.

При пробе на совместимость используется кровь донора, спущенная через иглу из флакона, приготовленного для переливания.

Во всех случаях эритроциты 3-4 раза отмываются в пробирках от плазмы, путем добавления к одному объему эритроцитов 8-10 объемов изотонического раствора хлорида натрия, с последующим перемешиванием и центрифугированием при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 мин (до полного осаждения эритроцитов). После каждого центрифугирования надстой отсасывается.
III. ТЕХНИКА ПРОВЕДЕНИЯ РЕАКЦИЙ

Испытуемые эритроциты готовят в виде 5% взвеси, для чего одну каплю четырежды отмытых эритроцитов смешивают в пробирке с 19 каплями изотонического раствора хлорида натрия.

Одну каплю (0,05 мл) 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку и размазывают. Пластинку покачивают и в течение 3-х минут наблюдают, не наступила ли агглютинация эритроцитов. Если агглютинация не наступила, то сюда же добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса, капли тщательно перемешивают, после чего пластинку слегка покачивают, затем на одну-две минуты оставляют в покое и снова покачивают. Одновременно в течение 10 минут ведут наблюдение за результатом, который выражается в наличии или отсутствии агглютинации.
Трактовка результатов прямой пробы Кумбса.

Отсутствие агглютинации – отрицательная проба

Наличие агглютинации – положительная проба, что указывает на сенсибилизацию исследуемых эритроцитов, т. е. на абсорбцию на них антител, происшедшую in vivo в организме человека (новорожденного, больного). Если агглютинация исследуемых эритроцитов наступила до добавления к ним сыворотки для пробы Кумбса, результат прямой пробы не учитывается.
2. Непрямая проба Кумбса

Предназначенная для выявления изоантител в сыворотке крови обследуемого лица

Применяется в тех случаях, когда необходимо выяснить, содержатся ли в крови больного, беременной женщины, донора и т. д. изоиммунные антитела неполной формы и установить их специфичность. Для реакции используют сыворотку крови обследуемого лица и стандартные эритроциты заведомо известной специфичности. Среди этих 8-10 или более образцов эритроцитов должны быть различия по факторам других систем и очень важно, чтобы каждый из этих факторов содержался хоты бы в одном образце эритроцитов. Также в панель включаются образцы резус-отрицательных эритроцитов с различными сочетаниями антигенов других систем, так, чтобы среди них имелись Даффи-положительные и Даффи-отрицательные, которые, в свою очередь, делились бы на Келл-положительные и Келл-отрицательные, Кидд-положительные и Кидд-отрицательные и т. д. В качестве отрицательного контроля в реакцию по возможности включают эритроциты того лица, сыворотка которого исследуется.

Техника реакции

В штатив устанавливают ряд центрифужных или других пробирок объемом 3-10 мл, по числу образцов эритроцитов, включенных в реакцию. Пробирки маркируют и, согласно маркировке, вносят в них по 1 маленькой капле (0,01 мл) отмытых стандартных эритроцитов. В каждую пробирку накапывают три капли исследуемой сыворотки, пробирки сильно встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации пробирки вынимают из термостата, и эритроциты отмывают путем добавления до верха пробирки изотонического раствора хлорида натрия, перемешивания и последующего центрифугирования. Отмывание повторяют 3-4 раза, каждый раз тщательно отсасывая надстой, затем к отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси (при использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).

1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за результатом реакции в течение 20 минут.

Трактовка результатов

Отсутствие признаков агглютинации (отрицательный результат) во всех образцах значит, что в исследуемой сыворотке не содержится неполных антител к групповым антигенам, которые содержатся в стандартных эритроцитах, включенных в исследование.

Если в некоторых или в большинстве капель, кроме контроля, наблюдается агглютинация , это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела против антигенов эритроцитов. Вопрос о специфичности этих антител решается по сопоставлению положительных и отрицательных реакций с антигенной структурой эритроцитов, включенных в реакцию. Вопрос об активности этих антител решается титрованием.

Пример 1. Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержащими фактор Rh 0 (D), независимо от наличия и от отсутствия других факторов этой системы и других систем, в то время, как со всеми Rh 0 (D) – отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось (так же независимо от наличия или отсутствия других факторов) – это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-резус – Rh 0 (D).

Пример 2 . Агглютинация имела место со всеми образцами эритроцитов, содержацими фактор Даффи, независимо от наличия или отсутствия антигенов системы резус и других систем, в то время, как со всеми Даффи-отрицательными образцами агглютинации не наблюдалось, это значит, что в исследуемой сыворотке содержатся неполные антитела анти-Даффи.

Дополнение. В случае, если в учреждении не имеется полной панели стандартных эритроцитов, но есть необходимость в исследовании сыворотки на наличие антител, рекомендуется провести исследование с 25-30 произвольно взятыми образцами эритроцитов здоровых лиц группы 0 (I) или одноименной с исследуемой сывороткой. Это даст возможность решить вопрос о наличии или отсутствии антител к большинству антигенов системы Rh-Hr, Даффи, Келл, Кидд.

При получении положительного результата дальнейшее заключение о специфичности выявленных антител может быть решено при специальном исследовании с полной панелью стандартных эритроцитов.

3. Техника проведения непрямой пробы Кумбса, как пробы на совместимость переливаемой крови

Для предупреждения несовместимости при переливании крови, перед трансфузией обязательно должны быть произведены следующие пробы на совместимость:

Проба на совместимость по группам крови АВО, которая производится на плоскости при комнатной температуре.
Пробы на совместимость по резус-фактору и другим изоантигенам.

Несовместимость по резус-фактору и по некоторым другим изоантигенам может зависеть как от наличия полных антител (определяемых в солевой среде при 37 0 С в пробирках) так и, чаще всего, от неполных антител, для чего наиболее чувствительной является непрямая проба Кумбса.

Одну маленькую (0,01 мл) каплю отмытых эритроцитов донора, взятых через иглу из флакона с кровью, предназначенной для переливания, переносят на дно центрифужной или другой пробирки объемом 3-4 мл и добавляют в нее 3 капли сыворотки больного. Пробирку встряхивают для перемешивания эритроцитов с сывороткой, после чего помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После инкубации добавляют в пробирку доверху изотонический раствор хлорида натрия, содержимое пробирки перемешивают и центрифугируют 5-10 мин. Такое отмывание эритроцитов повторяют 3 раза, каждый раз тщательно удаляя надстой. При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием. К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси.

1 каплю 5% взвеси эритроцитов переносят на белую пластинку, добавляют туда 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и тщательно перемешивают сыворотку с эритроцитами. Затем пластинку слегка покачивают, на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая результат в течение 20 минут.

Примечание: При несовместимости по резус-фактору агглютинация обычно наступает в течение первой минуты, однако при низком титре резус-антител (или других антител) агглютинация может наступить позже, иногда к двадцатой минуте.
Трактовка результата:

Агглютинаты видны в виде комочков на просветленном или полностью обесцвеченном фоне – это значит, что кровь донора несовместима с кровью реципиента и не может быть ему перелита.

Отсутствие признаков агглютинации означает, что кровь больного не содержит неполных антител к эритроцитам донора в отношении резус-фактора и других изоантигенов, к которым могли образоваться антитела неполной формы.

Непрямая проба Кумбса является чувствительной только в отношении неполных антител.
4. Техника непрямой проба Кумбса для определения антигенной структуры эритроцитов

Данная проба используется для определения наличия или отсутствия какого-либо группового антигена эритроцитов при помощи стандартной сыворотки, содержащей соответствующие антитела в неполной форме.

Наиболее часто непрямая проба Кумбса используется при определении антигенов Келл (К), Даффи (Fy), Кидд (Jk), и также для определения слабого антигена системы резус (Du).

Прежде, чем приступить к определению антигенов, исследуемые эритроциты следует проверить в прямой пробе Кумбса. При положительном результате прямой пробы – определение антигенов непрямой пробой Кумбса провести нельзя и для этой цели нужно применить другие реакции.

Для реакции используют центрифужние или другие пробирки объемом 3-4 мл в количестве трех: одну – для исследуемого образца эритроцитов и две для На дно первой пробирки вносят 1 маленькую (0,01 мл) каплю трижды отмытых испытуемых эритроцитов, во вторую - контрольные эритроциты, содержащие искомый антиген (например, Даффи- положительные) и в третью пробирку – отрицательный контроль (Даффи – отрицательные). Во все пробирки добавляют по 2-3 капли стандартной сыворотки (в данном примере анти-Даффи). Пробирки встряхивают для перемешивания содержимого и помещают в термостат при 37 0 С на 45 мин. После такой инкубации пробирки вынимают из термостата, доливают в них доверху изотонический раствор хлорида натрия, тщательно перемешивают содержимое и центрифугируют при1500-2000 тыс. об/мин в течение 5-10 мин. После центрифугирования надстой тщательно отсасывают и такое отмывание эритроцитов повторяют 4 раза. (При использовании центрифужных пробирок можно ограничиться двухкратным отмыванием).

К отмытым эритроцитам добавляют 2 капли изотонического раствора хлорида натрия для получения приблизительно 5% взвеси. 1 каплю 5% взвеси эритроцитов из каждой пробирки переносят на белую пластинку, к каждой капле эритроцитов добавляют 1-2 капли стандартной сыворотки для пробы Кумбса и перемешивают. Пластинку слегка покачивают, затем на 1-2 минуты оставляют в покое и снова периодически покачивают, одновременно наблюдая за ходом реакции в течение 20 минут.
Трактовка результатов

Наличие агглютинации эритроцитов (положительный результат) означает, что кровь содержит искомый антиген (в данном примере – кровь Даффи-положительная).

Отсутствие агглютинаци (отрицательный результат) означает, что исследуемая кровь не содержит искомого антигена (Даффи-отрицательная).

Результат учитывается как истиный после проверки контрольных образцов, т. е. в примере при положительном результате с Даффи-положительным образцом и отрицательном – с Даффи-отрицательным образцом.

5. Форма выпуска

Реактив выпускается в жидкой форме во флаконах объемом 5 или 10 мл (1 мл содержит 10 доз). В качестве консерванта применяется азид натрия в конечной концентрации 0,1%.

6.Хранение

Срок хранения - два года в холодильнике при 2-8°С. Вскрытый флакон годен к использованию при хранении в холодильнике в герметично закрытом виде в течение всего срока годности.

Основаниями для рекламации являются: отсутствие активности, неспецифичность, нарушение целостности флакона, наличие хлопьев, истекший срок годности реагента. При составлении рекламации просим указать дату получения, поставщика (если Вы получили товар не от производителя), номер серии, причины, по которым реагент признан негодным. Просим приложить протокол с результатами проверки реагента и 2-3 невскрытых флакона с реактивом
Рекламацию следует направить на предприятие-изготовитель ООО «МЕДИКЛОН»: 127276