Назначение рск микробиология. Реакция связывания комплемента (РСК). Реакции с участием комплемента

Реакция связывания комплемента заключается в том, что соединение антигена с соответствующим ему антителом извлекает из свежей сыворотки и прочно удерживает (связывает) находящийся в ней комплемент. Применяется для обнаружения антител и определения природы антигенов. При отсутствии специфического сродства между антигеном и сывороткой адсорбция комплемента не происходит.
Для проведения этой реакции необходимы следующие ингредиенты:
- 3 или 5%-ная взвесь эритроцитов барана;
- гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
- комплемент в дозе, установленной титрованием; антиген, не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни его задержки, в дозе, установленной титрованием;
- испытуемая сыворотка, активированная при 56°С в течение 15–30 мин в водяной бане и разведенная 1: 5 или 1: 10; стерильный физиологический раствор (0,85%).
Эритроциты барана. Эритроциты барана получают накануне постановки реакции пункцией яремной вены у барана в асептических условиях при помощи канюли. Кровь собирают в стерильную банку, содержащую стеклянные бусы, которые встряхивают для дефибринирования в течение 10–15 мин. После этого кровь фильтруют через несколько слоев марли и производят трехкратное отмывание эритроцитов в физиологическом растворе на центрифуге. Последняя порция промывной жидкости должна быть бесцветной.
Для постановки реакции применяется 1–3%-ная взвесь эритроцитов, которая готовится из 1 мл осадка отмытых эритроцитов + 33 мл физиологического раствора. В холодильнике эритроциты могут сохраняться пять-шесть дней. Для более длительного хранения их отмывают в жидкости Рингер-Локка следующего состава: NaCl – 9,0 г, КСl – 0,2 г, СаСl2 – 0,2 г, NaHСО3 – 1,0 г на 1 л дистиллированной воды. Жидкость стерилизуют паром в течение 30 мин, а затем добавляют 10 г кристаллической борной кислоты. На леднике эта жидкость может храниться две-три недели.
Консервировать эритроциты можно также и формалином, добавляя к 10 мл осадка эритроцитов 1 мл раствора формалина такого состава: 4 мл 40%-ного формалина на 200 мл физиологического раствора.
Гемолитическая сыворотка. Для получения гемолитической сыворотки кроликам внутривенно вводят три-четыре раза 50%-ную взвесь бараньих эритроцитов по 2–5 млн. с интервалами в два-три дня. На шестой-седьмой день после окончания иммунизации проверяют титр сыворотки. Если он не ниже 1: 1200, у животного берут кровь из сердца или из краевой вены уха. После инактивации на водяной бане при 55° С в течение 30 мин сыворотку консервируют с добавлением к ней 1 % сухой борной кислоты. Для консервирования сыворотки можно применять равный объем стерильного глицерина, прогретого при 180° С в течение 15 мин или добавлять 1 мл смеси на 9 мл сыворотки такого состава – карболовой кислоты 5,5 мл + глицерина 20 мл +74,5 мл дистиллированной воды. Можно использовать также 0,05%-ный хинозол. Сыворотку надо хранить в запаянных пробирках на леднике.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме.

В ряд пробирок последовательно отмеряют по 0,5 мл полученных разведений, начиная с 1: 1000. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов, 0,5 мл разведенного 1: 10 комплемента и 1 мл физиологического раствора. Отмеривать разведения сыворотки надо градуированной пипеткой, начиная с последней пробирки, содержащей минимальное разведение сыворотки, чтобы не нарушить точности разведений.
Ниже приводим схему титрования гемолитической сыворотки.

Титром гемолитической сыворотки называется ее максимальное разведение, 0,5 мл которого может растворить 0,5 мл взвеси эритроцитов при наличии 0,5 мл (разведенного) комплемента в течение 1 час при соответствующей температуре.
Гемолитическую сыворотку (гемолизин, гемолитический амбоцептор по Эрлиху) можно приобрести в соответствующих снабжающих организациях. Она отпускается в ампулах, содержащих 1–2 мл и бывает годной к употреблению в течение шести месяцев. На ампулах указан титр, т. е. предельное разведение сыворотки, которая, будучи смешана с равным объемом (по 0,5 мл) 10%-ного комплемента, полностью гемолизирует 0,5 мл взвеси бараньих эритроцитов после 1-часового стояния в термостате. Титр сыворотки время от времени необходимо проверять. Для постановки основного опыта, а также для титрования антигена и комплемента применяют разведение, которое в три раза меньше титра. Например, если титр равен 1: 1200, берут разведение 1: 400 (0,1 мл гемолитической сыворотки + 40 мл физиологического раствора).
После вскрытия ампулы оставшуюся сыворотку переливают в сухую стерильную пробирку и хранят на холоду.
Комплемент. Комплементарная функция выражена наиболее интенсивно в сыворотках млекопитающих животных и особенно в сыворотке морской свинки. Вот почему в качестве комплемента и применяется активная сыворотка морских свинок.
Сыворотку получают при помощи пункции сердца у трехпяти здоровых небеременных и не подвергавшихся обработке человеческим белком морских свинок, смешивая отдельные порции вместе. После образования сгустка фибрина последний отделяют от стенок пробирки, которую помещают в ледник. На следующий день отсасывают прозрачную сыворотку, которая называется комплементом. Для реакции необходимо употреблять только тот комплемент, который получен накануне, так как активность его сохраняется на леднике один-два дня. Комплемент можно консервировать добавлением 4%-ной борной кислоты и 5%-ного сернокислого натрия в сухом виде. После растворения указанных веществ комплемент помещают на ледник. Перед каждым выполнением опыта производится титрование комплемента для определения так называемой рабочей дозы. Приготовляют при помощи градуированной пипетки основное разведение комплемента 1: 10 (1 мл комплемента + 9 мл физиологического раствора), которое разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл, после чего доводят объем каждой пробирки физиологическим раствором до 1,5 мл, помещая их затем в термостат. Через 15 мин к 3%-ной взвеси бараньих эритроцитов прибавляют равный объем гемолизина, взятого в тройном титре. После трехкратного переливания из одного сосуда в другой полученную смесь выдерживают еще 30 мин в термостате. После этого во все пробирки с разведениями комплемента добавляют по 1 мл гемолитической смеси, тщательно встряхивают и снова помещают в термостат на 30 мин. В качестве двух контролей применяют: 1 мл гемолитической системы + 1,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл комплемента, разведенного 1: 10 + + 0,5 мл взвеси эритроцитов +1,5 мл физиологического раствора.
Титром комплемента называется то минимальное его количество, при наличии которого 0,5 мл гемолитической сыворотки в тройном титре способно лизировать 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов в течение 30 мин при 37° С.

В связи с антагонистическим влиянием на комплемент других ингредиентов (антиген, гемолитическая сыворотка), участвующих в реакции, практически дозу комплемента надо увеличить на 20–35%, представляющую собой так называемую рабочую дозу. Так, при титре 0,25 рабочая доза будет составлять 0,3–0,33. Однако, при употреблении антигенов с заведомо антикомплементарной способностью необходимо определить рабочую дозу комплемента при наличии антигена по следующей схеме.

Если же антиген не обладает антикомплементарными свойствами, то рабочая доза комплемента остается той, которая была определена титрованием комплемента per se.
Пункции сердца у одной и той же свинки можно повторять много раз с промежутками три-четыре недели.
Антиген. Антиген готовят из бактериальной культуры. Наиболее простым антигеном является взвесь в дистиллированной воде или физиологическом растворе микробов, убитых нагреванием при 60° С в течение 1 час или при 100° С в течение 15– 20 мин.
В качестве антигена может применяться также микробная взвесь, убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для получения антигена, обработанного алкоголем, поступают таким образом: взвесь 24-часовой агаровой культуры, предварительно промытую физиологическим раствором, центрифугируют. Жидкость декантируют, а осадок заливают 95°-ным спиртом в соотношении 1: 5, после чего оставляют на два-три дня при комнатной температуре. После удаления алкоголя осадок микробов заливают физиологическим раствором и консервируют добавлением 1%-ной сухой борной кислоты. Для реакции исходную взвесь разводят по оптическому стандарту, содержащему 1 млрд. бактериальных тел в 1 мл, употребляя ее в количестве 0,5 мл в качестве антигена.
Микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате или после обработки антиформином, также могут служить антигеном.
Для получения антигена при обработке культуры антиформином необходимо к суточной агаровой культуре бактерий, смытой 1,5 мл физиологического раствора, добавить 2 мл 3–4%-ного антиформина, нейтрализованного по лакмусу с добавлением 4%-ной H2SO4. Хлор удаляют нагреванием лизата на водяной бане при 55–65° С в течение 30 мин под контролем йод-крахмальной бумажки, приобретающей под влиянием хлора чернофиолетовое окрашивание.
Диализированный бактериальный полисахарид, а также полный антиген, полученный по методу Буавена, обладают высокими антигенными качествами.
У антигенов, полученных различными методами, определяют титр, а также антагонистические свойства в отношении активности комплемента (антикомплементарность) и гемотоксичность – способности вызывать лизис эритроцитов в отсутствии сыворотки и комплемента.
Титром антигена называют его количество в 1 мл при общем: объеме реакции в 2,5 мл, при которой происходит отчетливый гемолиз. Антиген берут в количестве 0,5 мл. Для определения рабочей дозы в ряд пробирок отмеривают антиген в количестве от 0,1; 0,2 и т.д. до 0,5 мл, к которым добавляют физиологический раствор до 1 мл. Затем прибавляют по 0,5 мл разведения комплемента, содержащего рабочую дозу и 0,5 мл физиологического раствора, встряхивают и помещают на 1 час в термостат. После этого вынимают из термостата и отмечают пробирку с максимальным содержанием антигена, в которой наблюдается еще гемолиз. Количество антигена в этой пробирке является показателем растворяющей дозы антигена. Ориентировочная доза антигена, необходимая для дальнейшего испытания, составляет 1/2 или 2/3 растворяющей дозы. Для определения специфичности ее испытывают затем с заведомо положительными и отрицательными сыворотками. При успешном титровании антигена такого рода найденную дозу принимают за его титр, которым и пользуются для постановки реакции. Схема определения ориентировочной дозы антигена следующая.

Антикомплементарность устанавливают путем параллельных фильтрований комплемента per se при наличии антигена, который не должен подавлять активность комплемента больше чем на 30%, в противном случае он не годится для реакции.
Для определения гемотоксичности к 1 мл антигена, разведенного по титру, добавляют 0,5 мл 3%-ной взвеси эритроцитов и 1 мл физиологического раствора и помещают на 1 час в термостат. Отсутствие гемолиза указывает на отсутствие гемотоксических свойств антигена. Следует отметить, что все антигены бактериального происхождения (взвеси, лизаты, экстракты) перед опытом обязательно подвергаются титрованию, за исключением бактериального алкогольного антигена, который вообще способен долгое время сохранять свой титр. Кроме того, бактериальная взвесь определенной концентрации (например, 1 млрд. клеток в 1 мл по оптическому стандарту) также исключает необходимость титрования, так как 0,5 мл такой взвеси лишена антикомплементарных и гемотоксических свойств. Сохранять антигены следует на леднике.
Сыворотки. Для определения неизвестного антигена применяется специфическая иммунная сыворотка, полученная путем иммунизации кроликов и обладающая большей частью высоким титром. Полученная сыворотка инактивируется в водяной бане при 55–56° С в течение 30 мин. Инактивирование проводится с целью стабилизации коллоидов сыворотки. Такая сыворотка может сохраняться в леднике пять-шесть дней. Срок хранения ее увеличивается до двух-трех недель, если к инактивированной сыворотке добавить 2% сухой борной кислоты или смеси из 4% сухой борной кислоты и 5% кристаллического сернокислого натрия. Сыворотки хранят в запаянных ампулах.
Проведение реакции. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент таким образом, чтобы количество каждого ингредиента равнялось 0,5 мл. После тщательного встряхивания каждой пробирки штатив помещают в термостат на 1 час при 37° С. Через 30 мин после этого готовят гемолитическую систему, т. е. смешивают в равных объемах 3%-ную взвесь эритроцитов барана с разведенной по утроенному титру гемолитической сывороткой. Смесь помещают на 30 мин в термостат. По истечении указанного срока во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, тщательно перемешивают и помещают в термостат на 40–60– 120 мин в зависимости от времени появления гемолиза в контрольных пробирках, не содержащих антигена. Затем производится первое определение результатов опыта, после чего штатив помещают в ледник на 12–18 час или оставляют при комнатной температуре. По истечении этого срока учитывают окончательные результаты опыта.
При наличии полного гемолиза (лаковая кровь) во всех четырех пробирках, взятых для исследования сыворотки, результат считается отрицательным. При положительных результатах в первых трех пробирках наблюдается задержка гемолиза, а в четвертой (контроль сыворотки), не содержащей антигена, – полный гемолиз. Степень задержки гемолиза принято обозначать количеством крестов.
(++++) – полная задержка гемолиза (жидкость бесцветна, значительный осадок неизмененных эритроцитов);
(+++) – ясная задержка (жидкость слабо-розового цвета, значительный осадок эритроцитов);
(++) – частичная задержка (жидкость интенсивно окрашена, довольно компактный осадок эритроцитов);
(+) – слабая задержка (жидкость интенсивно окрашена, незначительный осадок эритроцитов);
(±) – следы задержки (жидкость интенсивно окрашена, осадок в виде облачка);
(–) – полный гемолиз (жидкость интенсивно окрашена, отсутствие осадка, отрицательная реакция).
Приводим схему основного опыта.

реа́кция свя́зывания комплеме́нта , РСК, реакция Борде—Жангу [по имени бельг. бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологическая реакция, основанная на свойстве комплекса антиген—антитело фиксировать свободный комплемент (), применяемая при диагностике многих бактериальных и вирусных и некоторых протозойных и гельминтозных болезней, а также для изучения процессов, сопровождающихся изменением количества антигена или антител. РСК протекает в 2 фазы: 1) взаимодействие антител, антигена и комплемента, в результате которого свободный комплемент связывается образовавшимся комплексом антиген—антитело (специфическая фаза); 2) индикация реакции сенсибилизированной эритроцитами (неспецифическая фаза). В РСК используют 2 системы: специфическую бактериологическую, состоящую из антитела (испытуемой сыворотки), антигена и комплемента, а также неспецифическую «индикаторную», содержащую гемолизин (гемолитическая сыворотка) и взвесь эритроцитов барана. Антиген соединяется с антителом только в присутствии комплемента. Если испытуемая сыворотка содержит антитела, гомологичные взятому антигену, то присутствующий в реагирующей смеси комплемент адсорбируется образующимся комплексом антиген — антитело и теряет способность лизировать сенсибилизированные эритроциты, то есть без комплемента гемолизин (гемолитическое антитело) не разрушает эритроциты (реакция положительная). В тех случаях, когда между антигеном и антителами испытуемой сыворотки нет специфического родства, комплекс не образуется и комплемент остаётся в свободном состоянии. При добавлении гемолитической системы в этом случае несвязанный комплемент вызывает гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (реакция отрицательная). Существуют различные варианты постановки РСК: классический метод постановки в виде макро- и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количественной РСК по 50%-ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. В ветеринарной диагностической практике чаще применяют классический метод РСК в виде макроварианта, при котором берут каждого компонента по 0,5 или 0,25 мл в определённом рабочем титре. Комплемент титруют в бактериологической системе на сыворотках того же вида животных, кровь которых подлежит исследованию. Испытуемые сыворотки обычно исследуют в разведении 1:5 и 1:10 с антигеном и 1:5 без антигена (контроль). Время связывания комплемента в специфической фазе 20 мин, время реакции гемолиза в неспецифической фазе 20 мин при t 37—38ºC. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод — РДСК. При этом первую фазу реакции проводят при t 4—6ºC в течение 16—18 ч, что ведёт к усилению адсорбции комплемента малыми количествами антигена и антител. Затем добавляют гемолитическую систему и реакция протекает при t 37—38ºC в течение 20 мин. Результаты РСК и РДСК учитывают по степени задержки гемолиза, которую обозначают крестами или минусом, соответствующими следующим процентам гемолиза эритроцитов: ++++ от 0 до 10%; +++ от 10 до 40%; ++ от 40 до 70%; + от 70 до 90%; – от 90 до 100%. Ветеринарным законодательством предусмотрены специальные наставления по постановке, учёту и оценке РСК и РДСК для каждой болезни отдельно.

Литература:
Лабораторные исследования в ветеринарии, М., 1971;
Руководство по иммунологии, под ред. О. Е. Вязова и Ш. Х. Ходжаева, М., 1973.

Ветеринарный энциклопедический словарь. - М.: "Советская Энциклопедия" . Главный редактор В.П. Шишков . 1981 .

Смотреть что такое "" в других словарях:

Реакция связывания комплемента - (РСК) серол. реакция, используемая для количественного определения комплементсвязывающих Ат и Аг. Принцип РСК состоит в том, что специфический иммунный комплекс полностью или частично адсорбирует добавленный в систему С. В качестве… … Словарь микробиологии

реакция связывания комплемента - РСК Лабораторный метод. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РСК EN complement fixation testCFTCF test … Справочник технического переводчика

Реакция связывания комплемента - I Реакция связывания комплемента серологическая реакция, используемая для определения антигена или антитела, основанная на оценке потребления (связывания) комплемента комплексами антиген антитело, см. Иммунологические методы исследования. II… … Медицинская энциклопедия

реакция связывания комплемента - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… …

реакция связывания комплемента - (РСК), высокочувствительная и специфическая серологическая реакция, применяемая для диагностики многих инфекционных и инвазионных болезней животных. Состоит из двух последовательных фаз. В первой фазе антиген смешивают с испытуемой сывороткой и… … Сельское хозяйство. Большой энциклопедический словарь

реакция связывания комплемента - (РСК; син.: Борде Жангу реакция, реакция отклонения комплемента устар., реакция фиксации алексина устар.) метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген антитело связывать комплемент, что выявляется… … Большой медицинский словарь - rus реакция (ж) связывания комплемента, реакция (ж) Борде Жангу; реакция (ж) отклонения комплемента; реакция (ж) фиксации алексина eng complement fixation test fra réaction (f) de fixation du complément deu Komplementbindungsreaktion (f) spa… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Комплемента связывания реакция - см. Реакция связывания комплемента. (

Реакция гемолиза.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.

Компоненты РГ.

1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;

2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;

3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз ). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.

Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь").

Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая , 2-ая – гемолитическая система.

Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается , поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.

РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК.

1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).

2 . Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).

3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.

4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.

5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).

6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК.

Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в 2 фазы .

I фаза – специфическая : в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.

II фаза – индикаторная : в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.

Учет результатов РСК проводятпри безупречных результатах в контролях.

Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".

В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой , реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу в 1901. Которые установили, что при образовании комплекса антиген – антитело происходит связывание им комплемента.

Образовавшееся соединение мелкодисперсно и не определяется визуально. Для выявления адсорбции (связывания) комплемента авторы применили индикаторную гемолитическую систему: эритроциты барана и гемолитическую сыворотку. Если в испытуемой системе антиген не соответствует антителу, иммунный комплекс не образуется, комплемент остаётся свободным. Комплемент адсорбируется только на комплексе антиген - антитело, отдельно на антигене или антителе он не адсорбируется. Поэтому при добавлении к испытуемой системе гемолитической системы, состоящей из уже готового комплекса антиген - антитело (эритроциты барана и антитела к ним), комплемент присоединяется к этому комплексу, вызывая гемолиз эритроцитов барана - видимый результат.

Реакция связывания комплемента (РСК) отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РСК применяется в серодиагностике гонореи, сифилиса, коклюша, всех риккетсиозов, многих вирусных заболеваний. Как и другие серологические реакции, РСК можно применить и для серотипирования.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют две системы антиген - антитело и комплемент.

Для постановки РСК необходимы:

Сложность реакции обуславливается количеством участвующих ингредиентов и, главным образом, необходимостью определять точные количественные соотношения их. Поэтому постановке основного опыта предшествует титрование её ингредиентов.

Гемолитическая сыворотка готовится в производственных условиях путем 3-4 кратной внутривенной иммунизации кролика 50 % взвесью бараньих эритроцитов и инактивируется при 56 °С в течение 30 мин. Для её титрования берутся последовательно уменьшающиеся дозы (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% взвесь эритроцитов, комплемент 1:10 в равных объёмах (но 0,5 мл). На этикетке ампул с гемолитической сывороткой обозначен её титр - максимальное разведение, которое обеспечивает полный лизис 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента в течение часа при 37°С. Для РСК используют разведение сыворотки, увеличенное против титра в 3 раза.

Взвесь эритроцитов барана 3% получают из дефибринированной крови барана путем отмывания изотоническим раствором NaCl.

Комплемент - свежая сыворотка крови морской свинки или высушенная - титруется перед опытом: последовательно уменьшающиеся дозы (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + гемолитическая система (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). После инкубации в термостате при 37°С определяют титр комплемента - наибольшее разведение, которое вызывает полный лизис эритроцитов в присутствии гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента должна быть выше титра на 25%, т.к. активность комплемента в опыте может оказаться несколько подавленной другими комплементами реакции (антиген, сыворотка).

Антиген - взвесь убитых микроорганизмов, их лизаты, полные антигены, гаптены, экстракты тканевых липидов -иногда связывает комплемент даже в отсутствии иммунной сыворотки, поэтому его также необходимо оттитровать. Берутся последовательно уменьшающиеся дозы антигена + рабочая доза комплемента + гемолитическая система. Титром антигена является его наименьшая доза, при которой наступает отчётливый гемолиз. Для РСК берут дозу антигена, вдвое уменьшенную против титра во избежание связывания комплемента.

Исследуемая сыворотка перед опытом подвергается инактивированию при 56°С в течение 30 мин. Для инактивирования её собственного комплемента.

Все компоненты реакции связывания комплемента берутся в равных объёмах.

Постановка основного опыта.

После установления титра и рабочих доз всех ингредиентов ставят основной опыт РСК. В реакции участвует также титрованные сыворотки: заведомо здорового и заведомо больного (отрицательно и положительная сыворотки соответственно). Как и испытуемую сыворотку, контрольные - тоже инактивируют при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в две фазы:

I фаза - специфическая - инкубация смеси антигена, антитела и комплемента в термостате при 37°С в течение 30 мин.

II фаза - индикаторная - определение наличия в смеси свободного комплемента путем добавления гемолитической системы (предварительно помешенной на 30 мин. в термостат) и инкубации в термостате при 37°С в течение 20 -30 мин.

Результаты опыта оценивают, отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках (см. табл.). Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной, когда жидкость интенсивно окрашивается ("лаковая кровь"). Степень интенсивности гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величине осадка эритроцитов на дне (+ + + +, + + +, + +, +).

Учёт результатов РСК.

Учитывать результаты опыта (испытуемой сывороткой) можно лишь в том случае, если все контроля прошли правильно.

В пробирке №2 с положительной сывороткой (содержащей антитела к данному антигену) гемолиза не должно быть, т.к. комплемент связан в первой специфической системе, а гемолитическая система осталась без комплемента - эритроциты оседают на дно, надосадочная жидкость прозрачна.

В пробирке №3 с отрицательной сывороткой, сывороткой здорового человека, не содержащей антитела к данному антигену, гемолиз должен быть, поскольку в первой фазе реакции не произошло образование комплекса антиген -антитело (из - за отсутствия антител к данному антигену) и комплемент остался свободным. При добавлении гемосистемы во II фазе реакции комплемент адсорбировался на готовом иммунном комплексе эритроциты барана плюс антитела к ним; произошел лизис эритроцитов барана (гемолиз).

Наличие гемолиза в контроле сыворотки и антигена (пробирки №4 и 5) указывает, что их дозы были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемента не связывают. Оставшийся свободным в специфической системе комплемент адсорбируется иммунным комплексом гемолитической системы, происходит гемолиз.

Гемолиз в контроле комплемента (пробирка №6) свидетельствует об активности комплемента и правильности выбора его рабочей дозы.

В контроле гемолитической системы (пробирка №7) при правильной работе этой системы не должно быть даже следов гемолиза, т.к. в ней отсутствует комплемент.

При безупречных контрольных результатах можно учитывать опыт (пробирка №1). Отсутствие гемолиза расценивают как положительный результат. Он свидетельствует о том, что в испытуемой сыворотке обнаружены антитела к данному антигену (человек болен). При соответствии антигена антителу образуется комплекс антиген - антитело, который связывает комплемент (I фаза). При добавлении гемолитической системы гемолиза эритроцитов во II фазе не будет. Наличие гемолиза является отрицательным результатом, свидетельствующим об отсутствии антител к данному антигену (человек здоров). Комплемент остается свободным и при добавлении гемолитической системы присоединяется к комплексу эритроцит - гемолизины, вызывая гемолиз.

Страница 33 из 91

Реакция связывания комплемента (РСК)
Соединение антитела с антигеном и комплементом не обязательно сопровождается разрушением антигена. Это. в большей степени относится к микробам, которые проявляют устойчивость к литическому действию комплемента. Происходящее в таких случаях связывание комплемента может быть выявлено непрямым путем с помощью метода, открытого Ж. Борде и С. Жангу. Сущность метода заключается в следующем. При взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном происходит соединение антигена с антителом, образуется комплекс антитела с антигеном, который связывает комплемент. В случае несоответствия антигена и антитела связывания комплемента не происходит, т. е. комплемент остается свободным. Процесс связывания комплемента при положительной реакции антитела с антигеном остается невидимым. Поэтому для определения, связался ли комплемент или остался свободным, в качестве индикатора в реакцию вводится гемолитическая система (гемолитическая сыворотка - гемолизины и эритроциты барана). Реакция связывания комплемента ставится в две фазы: в первой фазе к исследуемой сыворотке (антителу) добавляется антиген и комплемент, во второй - добавляется гемолитическая система.
Если в первой фазе реакции исследуемая сыворотка содержит специфические для антигена антитела, то комплемент будет связан с комплексом антиген+антитело, при добавлении гемолитической системы гемолиз не произойдет и реакция будет считаться положительной.
Если же исследуемая сыворотка не содержит специфических антител, т. е. антиген и антитела не соответствуют друг другу, тогда комплемент в первой фазе реакции остается свободным и при добавлении гемолитической системы произойдет гемолиз (растворение) эритроцитов, т. е. реакция будет отрицательной (см. рис. 57).
Реакция Борде-Жангу (реакция связывания комплемента), обладающая высокой чувствительностью, приобрела большое диагностическое значение. Это значение еще больше увеличилось, когда Жангу показал, что реакция может происходить не только с бактериальными телами, но и с их экстрактами. Реакция Борде-Жангу применяется при диагностике сапа, гонореи и других заболеваний. А. Вассерман, исходя из идеи Ж. Борде, применил реакцию связывания комплемента для серодиагностики, сифилиса. Эта реакция получила практическое применение в распознавании сифилиса.
Реакция связывания комплемента применяется с двоякой целью:

1. Для обнаружения в сыворотке специфических антител с помощью известного антигена. Например, имея антиген, приготовленный из культуры гонококка, можно обнаружить гонококковые антитела в сыворотке больного. В этом случае необходимо пользоваться антигеном, доза которого, связывающая комплемент, заранее вытитрована на значительном количестве сывороток больных.
2. Для определения вида антигена при помощи сыворотки, содержащей антитела к определенному антигену. Например, при помощи соответствующей иммунной сыворотки можно идентифицировать палочку коклюша. В этих случаях необходимо иметь сильную иммунную сыворотку, титр которой известен.

Ингредиенты (составные части) реакции. Для реакции связывания комплеме-нта необходимы следующие ингредиенты: 1) эритроциты барана, 2) гемолитическая сыворотка, 3) комплемент, 4) антиген и 5) испытуемая сыворотка.
1. Эритроциты получают из дефибрин ированной крови барана. Для этого у барана берут кровь из яремной вены непосредственно в банку со стеклянными бусами. Встряхивают в течение 10 минут. Процеживают через стерильную марлю, центрифугируют и сыворотку отсасывают. Три раза отмывают эритроциты от остатка сыворотки физиологическим раствором хлористого натрия центрифугированием в течение 10-15 минут. После третьего центрифугирования из осадка приготовляют 3% взвесь эритроцитов для опыта. При хранении в леднике дефибринированная кровь может употребляться в течение 6-8 дней.

Схема приготовления разведений гемолитической сыворотки из основного разведения 1: 100

Пробирка	Основные разведения в мл	Физиологический раствор в мл	Полученное разведение

1. Гемолитическая сыворотка обычно получается от кроликов, иммунизированных эритроцитами барана. Гемолитическую сыворотку выпускают в сухом виде институты бактерийных препаратов. На этикетке ампулы указан титр сыворотки и срок годности.

Таблица 4
Схема титрования гемолитической сыворотки

Титром гемолитической сыворотки называется ее предельное разведение, способное в объеме 0,5 мл растворить 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов в присутствии 0,5 мл комплемента в течение часа при температуре 37°.
Титр гемолитической сыворотки определяется по следующей схеме: приготовляют основное разведение выворотки 1: 100 (0,1 мл сыворотки+0,9 мл физиологического раствора), из которого готовят дальнейшие разведения (табл. 3).
В ряд пробирок последовательно отмеривают по 0,5 мл полученных разведений гемолитической сыворотки, начиная с 1: 1000, добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл комплемента, разведенного 1:10, и по 0,5 мл 3% взвеси эритроцитов. Титрование гемолитической сыворотки проводится по схеме (табл. 4).
Из схемы видно, что данная сыворотка еще в разведении 1: 1500 дает полный гемолиз (т. е. титр сыворотки 1: 1500). В дальнейшем для опыта берут в 3 раза меньшее разведение (тройной титр). Так, например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1500, применяется разведение 1:500 (т. е. 0,1 мл сыворотки 49,9 мл физиологического раствора).

1. Комплемент. В качестве комплемента в реакции служит сыворотка морских свинок (их комплемент обладает наибольшей активностью) или сухой комплемент, выпускаемый институтами бактерийных препаратов.

Так как степень активности комплемента не у всех морских свинок одинакова, необходимо брать кровь у нескольких животных и полученные сыворотки смешивать.
Титром комплемента обозначается первая минимальная доза комплемента, растворяющая эритроциты. Если, например, в приведенной схеме титрования полный гемолиз произошел в пробирке, содержащей 0,3 мл комплемента, и неполный гемолиз оказался в пробирке, содержащей 0,25 мл комплемента, то титром комплемента надо считать 0,3 мл в разведении 1: 10. В качестве рабочей дозы комплемента обычно берется титр его, увеличенный на 20-25%, т. е. приблизительно это соответствует тому количеству комплемента, которое содержится в предпоследней пробирке с гемолизом.
Как при титровании гемолитической сыворотки, так и при титровании комплемента ставятся два контроля (см. табл. 5).

Схема титрования комплемента без антигена


Таблица 6
Схема титрования комплемента в присутствии антигена

Кроме того, рекомендуется титровать комплемент также в присутствии антигена.
Титрование комплемента в присутствии антигена необходимо в тех случаях, когда антиген подавляет титр комплемента (антикомплементарное свойство антигена). Это свойство может зависеть как от природы самого антигена, так и от способа его приготовления.

1. Антиген. В реакции связывания комплемента используются различные антигены. Антигенами являются культуры разнообразных микробов или экстракты патологически измененных или нормальных тканей. В качестве бактериального антигена могут употребляться как взвеси микробов в физиологическом растворе, так и экстракты из микробов, приготовленные различными способами (например, антиформиновый гонококковый антиген, спиртовой туберкулезный и т. п.). Хорошими антигенными свойствами обладает микробная взвесь, предварительно убитая парами формалина или обработанная алкоголем. Для реакции исходную взвесь антигена разводят по оптическому стандарту, содержащему. 1 млрд. микробных тел в 1 мл, и берут в объеме 0,5 мл.

В качестве антигена применяют также микробные лизаты в дистиллированной воде или физиологическом растворе, полученные в шюттель-аппарате (аппарат для встряхивания) или путем обработки антиформином.
Для реакции следует употреблять такую дозу антигена, которая вызывает полную задержку гемолиза с сыворотками, содержащими соответствующие гемолизины, но которая сама по себе задержки гемолиза не дает. В силу того, что все микробные антигены адсорбируют какое-то количество комплемента, перед титрованием их проверяют на антикомплементарные свойства, определяя растворяющую дозу комплемента, т. е. то наибольшее количество антигена, которое не вызывает задержки гемолиза. Определение такой растворяющей дозы антигена производится по схеме (табл. 7).
Из таблицы видно, что в данном примере растворяющая доза антигена составляет 0,4 мл. Для опыта берут половину такой дозы, т. е. ориентировочная доза будет равна 0,2 мл.

1. Испытуемая сыворотка. Сыворотку больного отделяют от сгустка через 3-48 часов после взятия крови и инактивируют в водяной бане при 56° в течение 30 минут.

Таблица 7 Схема определения растворяющей дозы антигена

Пробирка	Антиген в мл	Физиологический раствор в мл	Рабочая доза комплемента в мл	Гемолитическая система в мл	Результат
					1 Стояние в термостате при 37° в течение часа
					^ Задержка гемолиза

Инактивированные сыворотки могут сохраняться в холодильнике в течение 5-6 дней. Для реакции сыворотка больного применяется в разведении 1:5 (0,1 мл сыворотки+0,4 мл физиологического раствора).
Постановка опыта реакции связывания комплемента (табл. 8).
Для постановки реакции связывания комплемента необходимы следующие ингредиенты:

1. физиологический раствор (0,85%);
2. сыворотка, подлежащая исследованию, инактивированная при 56° в течение 30 минут в водяной бане;
3. антиген (взвесь бактерий или экстракт из них), не вызывающий самостоятельно ни гемолиза, ни задержки его в дозе, установленной титрованием;
4. комплемент в рабочей дозе, установленной титрованием;
5. гемолитическая сыворотка в дозе, соответствующей ее утроенному титру;
6. 3% взвесь бараньих эритроцитов.

Каждый из ингредиентов, который применяется для реакции, берется в количестве 0,5 мл. Если доза отдельного компонента меньше этого объема, то ее дополняют физиологическим раствором до 0,5 мл.
Основной опыт связывания комплемента желательно ставить сразу с двумя - тремя антигенами, приготовленными различным способом (А1, А2, А3 в табл. 8).

Схема основного опыта

Для контроля необходимо одновременно ставить реакцию точно в тех же условиях с нормальной сывороткой и сывороткой, заведомо дающей положительный результат. При постановке реакции сначала смешивают исследуемую сыворотку, антиген и комплемент. Смесь выдерживают при 37° в течение часа. По истечении указанного срока в пробирку добавляют смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов - гемолитическую систему. Гемолитическую систему добавляют или непосредственно после приготовления смеси из равных объемов гемолитической сыворотки и эритроцитов, или после получасового выдерживания этой смеси в термостате. Смесь всех ингредиентов после энергичного встряхивания помещают в термостат при 37° на 1 час, а затем на 12 часов переносят в холодильник или оставляют при комнатной температуре.
В пробирках, в которых произошел гемолиз, жидкость становится прозрачной, но окрашенной (см. рис. 58).

Рис. 58. Схема реакции связывания комплемента.
а - реакция положительная; б - реакция отрицательная.

Результат реакции обозначается или словами «положительная», «отрицательная» реакция, или знаком плюс (+) или минус (-). Но так как степень задержки гемолиза может колебаться в пределах от полной задержки до очень слабой, обозначения могут быть следующие:
(++ + +)-полная задержка гемолиза; жидкость не окрашена, значительный осадок эритроцитов;
(+ + +) -ясная задержка гемолиза; жидкость окрашена, осадок эритроцитов;
(++)-частичная задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно; компактный осадок эритроцитов;
(+)-очень слабая задержка гемолиза; жидкость окрашена интенсивно, осадок небольшой;
(±) -следы задержки гемолиза, при взбалтывании заметен незначительный осадок;
(-)-полный гемолиз (отрицательная реакция).