Индуцированные мутации бактерий. Химический мутагенез. Радиационный мутагенез. Типы мутаций. Радиационный мутагенез Химический и радиоактивный мутагенез

У Радиации нет порога!!!

Мутации, помимо качественных свойств, характеризует и способ возникновения. Спонтанные (случайные) - мутации, возникающие при нормальных условиях жизни. Спонтанный процесс зависит от внешних и внутренних факторов (биологические, химические, физические). Спонтанные мутации возникают у человека в соматических и генеративных тканях. Метод определенияопределения спонтанных мутаций основан на том, что у детей появляется доминантный признак, хотя у его родителей он отсутствует. Проведенное в Дании исследование показали, что примерно одна из 24000 гамет несет в себе доминантную мутацию. Ученый же Холдейн рассчитал среднюю вероятность появления спонтанных мутаций, которая оказалась равна 5*10-5 за поколение. Другой ученый Курт Браун предложил прямой метод оценки таких мутаций, а именно: число мутаций разделить на удвоенное количество обследованных индивидов.

Индуцированные мутации

Индуцированный мутагенез - это искусственное получение мутаций с помощью мутагенов различной природы. Впервые способность ионизирующих излучений вызывать мутации была обнаружена Г.А. Надсоном и Г.С. Филлиповым. Затем, проводя обширные исследования, была установлена радиобиологическая зависимость мутаций. В 1927 году американским ученым Джозефом Мюллером было доказано, что частота мутаций увеличивается с увеличением дозы воздействия. В конце сороковых годов открыли существование мощных химических мутагенов, которые вызывали серьезные повреждения ДНК человека для целого ряда вирусов. Одним из примеров воздействия мутагенов на человека может служить эндомитоз - удвоение хромосом с последующим делением центромер, но без расхождения хромосом.

Возникновение под влиянием ионизирующих излучений и ультрафиолетовых лучей наследственных изменений (мутаций). Под действием излучений возникают качественно те же мутации, что и без облучения, но значительно чаще; соотношение разных типов мутаций также может быть иным. Используется в генетических исследованиях, в селекции промышленных микроорганизмов, сельскохозяйственных и декоративных растений. Повышение частоты вредных мутаций в результате увеличения содержания в биосфере радиоактивных изотопов - одна из основных опасностей радиоактивного загрязнения биосферы.

Общая закономерность: с увеличением дозы - увеличивается степень повреждения системы; в процесс вовлекается все большее число составляющих её элементов.
В зависимости от действующей дозы практически всякое вещество в определенных условиях может оказаться вредным для организма.

На проявление зависимости доза-эффект оказывает существенное влияние внутри- и межвидовая изменчивость организмов. Действительно, особи, относящиеся к одному и тому же виду, существенно отличаются друг от друга по биохимическим, физиологическим, морфологическим характеристикам. Эти отличия в большинстве случаев обусловлены их генетическими особенностями. Еще более выражены, в силу тех же генетических особенностей, межвидовые различия. В этой связи дозы конкретного вещества, в которых оно вызывает повреждение организмов одного и того же и, тем более, разных видов, порой очень существенно различаются. Следовательно, зависимость доза-эффект отражает свойства не только токсиканта, но и организма, на который он действует. На практике это означает, что количественную оценку токсичности, основанную на изучении зависимости доза-эффект, следует проводить в эксперименте на различных биологических объектах, и обязательно прибегать к статистическим методам обработки получаемых данных.

Билет 17

Методы генетики

Совокупность методов исследования наследственных свойств организма (его генотипа) называется генетический анализ. В зависимости от задачи и особенностей изучаемого объекта генетический анализ проводят на популяционном, организменном, клеточном и молекулярном уровнях.

Основу генетического анализа составляет гибридологический анализ , основанный на анализе наследования признаков при скрещиваниях. Гибридологический анализ, основы которого разработал основатель современной генетики Г. Мендель, основан на следующих принципах:

1. Использование в качестве исходных особей (родителей), форм, не дающих расщепления при скрещивании, т.е. константных форм.

2. Анализ наследования отдельных пар альтернативных признаков, то есть признаков, представленных двумя взаимоисключающими вариантами.

3. Количественный учет форм, выщепляющихся в ходе последовательных скрещиваний и использование математических методов при обработке результатов.

4. Индивидуальный анализ потомства от каждой родительской особи.

5. На основании результатов скрещивания составляется и анализируется схема скрещиваний.

Цитогенетический метод заключается в цитологическом анализе генетических структур и явлений на основе гибридологического анализа с целью сопоставления генетических явлений со структурой и поведением хромосом и их участков (анализ хромосомных и геномных мутаций, построение цитологических карт хромосом, цитохимическое изучение активности генов и т. п.).

Генеалогический метод (метод анализа родословных). Позволяет проследить наследование признаков в семьях. Используется для определения наследственного или ненаследственного характера признака, доминантности или рецессивности, картирования хромосом, т. е. для установления принадлежности гена, кодирующего данный признак, к определенной группе сцепления, сцепленности с Х- или Y-хромосомами, для изучения мутационного процесса, особенно в случаях, когда необходимо отличить вновь возникшие мутации от тех, которые носят семейный характер, т. е. возникли в предыдущих поколениях

Близнецовый метод , заключающийся в анализе и сравнении изменчивости признаков в пределах различных групп близнецов, позволяет оценить относительную роль генотипа и внешних условий в наблюдаемой изменчивости. Особенно важен этот метод при работе с малоплодовитыми организмами, имеющими поздние сроки наступления половой зрелости (например, крупный рогатый скот), а также в генетике человека.

Популяционный метод. На основе популяционного метода изучают генетическую структуру популяций различных организмов: количественно оценивают распределение особей разных генотипов в популяции, анализируют динамику генетической структуры популяций под действием различных факторов (при этом ис­пользуют создание модельных популяций). изучение частоты аллелей, при тех или иных изменениях.

Молекулярно-генетический метод представляет собой биохимическое и физико-химическое изучение структуры и функции генетического материала и направлен на выяснение этапов пути «ген --> признак» и механизмов взаимодействия различных молекул на этом пути. Изучение молекул ДНК и РНК и их роль в наследственности, и в вопросах экспрессии ген.

Онтогенетический метод соприкасается с эмбриологическим (как из одной зиготы, происходит развитие сложного организма).

Мутационный метод позволяет (на основе всестороннего анализа мутаций) установить особенности, закономерности и механизмы мутагенеза, помогает в изучении структуры и функции генов. Особое значение мутационный метод приобретает при работе с организмами, размножающимися бесполым путём, и в генетике человека, где возможности гибридологического анализа крайне затруднены.

Математические методы(статистический)- обработка результатов, и показать насколько отклонения носят закономерный характер или являются случайными.

Теория хромосомы

Хромосомная теория наследственности - теория, согласно которой передача наследственной информации в ряду поколений связана с передачей хромосом, в которых в определённой и линейной последовательности расположеныгены. Эта теория сформулирована в начале XX века, основной вклад в её создание внесли американский цитолог У. Сеттон(Walter Sutton ), немецкий эмбриолог Т. Бовери и американский генетик Т. Морган со своими сотрудниками К. Бриджесом, А. Стёртевантом (A.H.Sturtevant ) и Г. Мёллером .

В 1902-1903 годах У. Сеттон и Т. Бовери независимо друг от друга выявили параллелизм в поведении менделевскихфакторов наследственности (генов) и хромосом. Эти наблюдения послужили основой для предположения, что гены расположены в хромосомах. Экспериментальное доказательство локализации генов в хромосомах было получено позднее Т. Морганом и его сотрудниками, работавшими с плодовой мушкой Drosophila melanogaster . Начиная с 1911 года, эта группа опытным путём доказала, что гены располагаются в хромосомах линейно; что находящиеся на одной хромосоме гены наследуются сцепленно; что сцепленное наследование может нарушаться за счёткроссинговера . Основные выводы сформулированной ими хромосомной теории наследственности были опубликованы в 1915 году в книге «Механизм менделевской наследственности» .

В 1933 году Томасу Моргану за открытие роли хромосом в наследственности была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине .

По мнению Н. В. Тимофеева-Ресовского, высказанного им в 1964 году «…вся экспериментальная генетика XX века была ни чем иным, как развитием и анализом деталей хромосомной теории наследственности» .

Первые описания хромосом[править | править вики-текст]

Начальным этапом создания хромосомной теории наследственности можно считать первые описания хромосом во время деления соматических клеток, сделанных во второй половине XIX века в работах И. Д. Чистякова (1873), А. Шнейдера (1873), а главным образом Э. Страсбургера (1875) иО. Бючли (1876). Термина «хромосома» тогда ещё не существовало, и вместо него говорили о «сегментах», на которые распадается хроматиновый клубок, или о «хроматиновых элементах». Термин «хромосома» был предложен позднее Г. Вальдейером в его сводной статье 1888 года .

Параллельно с изучением соматических митозов шло и изучение процесса оплодотворения, как в животном, так и врастительном царстве. Слияние семенного ядра с яйцевым впервые наблюдал у иглокожих О. Хертвиг (1876), а среди растений у лилейных Страсбургер (1884). Именно на основании этих наблюдений в 1884 году оба они пришли к выводу, что клеточное ядро является носителем наследственных свойств организма .

Центр внимания с ядра, как целого, на его отдельные хромосомы был перенесён лишь после того, как появилась чрезвычайно важная для того времени работа Э. ван Бенедена (1883) . Ему при изучении процесса оплодотворения у аскариды, имеющей очень малое число хромосом - всего 4 в соматических клетках, удалось подметить, что хромосомы в первом делении оплодотворённого яйца происходят наполовину из ядра сперматозоида и наполовину - из ядра яйцеклетки . Таким образом, во-первых, был открыт факт, что половые клетки имеют вдвое меньшее количество хромосом по сравнению с соматическими клетками, а во-вторых, был впервые поставлен вопрос о хромосомах, как особых постоянных сущностях в клетке .

Индивидуальность хромосом. Работы Бовери[править | править вики-текст]

Следующий этап связан с развитием концепции индивидуальности хромосом. Одним из первых шагов было установление того, что соматические клетки разных тканей одного и того же организма обладают одинаковым числом хромосом. Первым на это ясно и вполне определённо указал австрийский зоолог Карл Рабль в 1885 году в своей статье «О клеточном делении» . Экспериментальное обоснование закона индивидуальности хромосом было обеспечено работами немецкого зоолога Теодора Бовери, а именно - целым рядом классических исследований, посвящённых хромосомам: «Этюды о клетке» (1887-1890 и далее), «Данные о строении хроматинового вещества ядра» (1904) и др. . Уже с самых первых работ, вышедших в 1887 и 1888 годах Бовери решительно высказался в пользу того, что «хроматиновые элементы являются самостоятельными элементами, сохраняющими эту самостоятельность и в покоящемся ядре». Таким образом, согласно этому взгляду, хотя хромосомы ясно видны лишь во время митоза, но и на стадии интерфазы хромосомы не исчезают, а сохраняют свою обособленность и самостоятельность. Бовери также выдвинул гипотезу о качественном различии хромосом, согласно которой каждая хромосома отличается по своему внутреннему наследственному составу от других хромосом, входящих в состав того же ядра . В серии блестящих экспериментов (1902-1907) над яйцами морских ежей, оплодотворённых двумя спермиями, Бовери продемонстрировал, что нарушения нормального развития находятся в строгом соответствии с ненормальным распределением хромосом. На большом статистическом материале Бовери показал, что для нормального развития требуется наличие всех хромосом, присущих виду .

Основные положения хромосомной теории наследственности[править | править вики-текст]

Анализ явлений сцепленного наследования, кроссинговера, сравнение генетической и цитологической карт позволяют сформулировать основные положения хромосомной теории наследственности:

· Гены локализованы в хромосомах. При этом различные хромосомы содержат неодинаковое число генов. Кроме того, набор генов каждой из негомологичных хромосом уникален.

· Аллельные гены занимают одинаковые локусы в гомологичных хромосомах.

· Гены расположены в хромосоме в линейной последовательности.

· Гены одной хромосомы образуют группу сцепления, то есть наследуются преимущественно сцепленно (совместно), благодаря чему происходит сцепленное наследование некоторых признаков. Число групп сцепления равно гаплоидному числу хромосом данного вида (у гомогаметного пола) или больше на 1 (у гетерогаметного пола).

· Сцепление нарушается в результате кроссинговера, частота которого прямо пропорциональна расстоянию между генами в хромосоме (поэтому сила сцепления находится в обратной зависимости от расстояния между генами).

· Каждый биологический вид характеризуется определенным набором хромосом - кариотипом.

Билет 18

Трансдукция

Трансдукция - перенос генов из одной бактериальной клетки в другую при помощи бактериофага. Впервые это явление установили в 1952 г. Н. Зиндер и Дж. Ледерберг. Они проводили исследования на патогенных для мышей бактериях Salmonella typhimurium. Были отобраны два штамма этих бактерий: штамм 22А ауксотрофный, не способный синтезировать триптофан (Т~), и штамм 2А, способный синтезировать триптофан (Т1"). Эти штаммы засевали в U-образную трубку, разделенную внизу бактериальным фильтром (рис. 24). В одно колено трубки засевали штамм 22А (Т~), в другое - штамм 2А (Г*). После определенного периода инкубации бактерии штамма 22А при посеве на минимальную питательную среду дали небольшое количество колоний (частота появления трансдуцированных клеток была равна 110~*). Это свидетельствовало о том, что некоторые клетки приобрели способность синтезировать триптофан. Каким же образом бактерии могли приобрести это свойство? Исследования показали, что штамм 22А был лизогенен по фагу Р-22. Этот фаг освобождался из лизогенной культуры, проходил через фильтр и лизировал штамм 2А. Присоединив часть генетического материала штамма 2А, фаг возвращался обратно и передавал этот генетический материал штамму 22А.

Штамм 22А приобретал специфические наследственные свойства штамма 2А, в данном случае свойство синтезировать триптофан. Аналогичным образом могут быть трансдуцированы и другие признаки, в том числе способность к сбраживанию, устойчивость к антибиотикам и т. д.

Явление трансдукции установлено также у кишечной палочки и актиномицетов. Как правило, трансдуцируется один ген, реже два и очень редко три сцепленных гена. При переносе генетического материала заменяется участок молекулы ДНК фага. Фаг при этом теряет свой собственный фрагмент и становится дефектным. Включение генетического материала в хромосому бактерии реципиента осуществляется механизмом типа кроссинговера. Происходит обмен наследственным материалом между гомологичными участками хромосомы реципиента и материала, привнесенного фагом.

Различают три вида трансдукции: общую, или неспецифическую, специфическую и абортивную. При неспецифической трансдукции в период сборки фаговых частиц в их головку вместе с фаговой ДНК может включиться любой из фрагментов ДНК пораженной бактерии. В результате в реципиентные клетки могут переноситься различные гены бактерии донора.

Неспецифическую трансдукцию могут осуществлять фаги Р-1 и Р-22 у эшерихий, шигелл и сальмонелл. При специфической трансдукции профаг включается в определенное место хромосомы бактерии и трансдуцирует определенные гены, расположенные в хромосоме клетки донора рядом с профагом. Например, фаг X (лямбда) в состоянии профага всегда включается в одно и то же место в хромосоме кишечной палочки и трансдуцирует локус, обусловливающий способность к сбраживанию галактозы. При отделении профагов от ДНК хозяина прилегающие к профагу бактериальные гены вместе с ним выщепляются из состава хромосомы, а часть генов профага остается в ее составе. Частота общей трансдукции составляет от 1 на 1 млн до 1 на 100 млн. Специфическая трансдукция происходит чаще.

Установлено, что фрагмент хромосомы донора, перенесенный в клетку реципиента, не всегда включается в хромосому реципиента, а может сохраняться в цитоплазме клетки. При делении бактерий он попадает только в одну из дочерних клеток. Такое состояние получило название абортивной трансдукции.

Действие мутагенов на наследственные структуры клеточного ядра неодинаково, поэтому возникают различные мутации трех типов , вызванные изменением количества хромосом, изменением структуры хромосом и изменением структуры гена (прилож. 1).

Мутации также разделяются на морфологические, физиологические и биохимические . Они могут изменять проявление любого внешнего признака, влиять на функции отдельных органов, рост и развитие организма, вызывать различные изменения химического состава клеток и тканей.

По проявлению мутации бывают доминантные и рецессивные , при этом рецессивные мутации возникают значительно чаще, чем доминантные. Мутационный процесс, как правило, идет от доминантности к рецессивности. Доминантные мутации проявляются сразу же в гетерозиготном состоянии, рецессивные – только тогда, когда мутированный ген окажется в гомозиготном состоянии.

По относительному влиянию на жизнеспособность и плодовитость организма мутации делятся на полезные , нейтральные и вредные . Полезные мутации повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды (к повышенной или пониженной температуре, возбудителям болезней и т. д.). Вредные мутации задерживают рост, развитие, вызывают гибель организма. Летальные мутации бывают доминантные , которые проявляются в первом поколении и быстро удаляются из популяции естественным отбором, и рецессивные , которые накапливаются в генотипе и проявляются в последующих поколениях.

Совокупность всех мутаций, возникающих у организма под действием мутагенного фактора, называют спектром мутаций . Большое разнообразие мутаций указывает на широкий спектр мутагенеза, а однотипные мутации – на узкий спектр.

Мутационная изменчивость происходит на разных этапах развития организма и во всех его клетках. Мутации, возникающие в половых клетках в гаметах и клетках, из которых образуются организмы, называются генеративными . Мутации, возникающие в соматических клетках организма, называются соматическими . По своей природе генеративные и соматические мутации ничем не отличаются, так как их возникновение связано с изменением структуры хромосом, и образуются они примерно с одинаковой частотой. Однако, по характеру проявления и значимости для эволюции и селекции различия между этими видами мутаций очень существенны. Генеративные мутации при половом размножении передаются следующим поколениям организмов. При этом доминантные мутации проявляются уже в первом поколении, а рецессивные – только во втором и последующих поколениях при переходе их в гомозиготное состояние. Соматические мутации возникают в диплоидных клетках, поэтому проявляются только по доминантным генам или по рецессивным генам в гомозиготном состоянии. Они имеют большое значение для эволюции организмов с вегетативным размножением.

Все мутации по степени их фенотипического проявления делят на два класса : крупные (или видимые) и малые . Крупные мутации легко обнаруживаются по появлению различных наследственных морфологических аномалий. Малые мутации проявляются через незначительные изменения физиологических, морфологических и любых количественных признаков. Крупные мутации выделяют путем отбора отдельных измененных растений во втором мутантном поколении (М 2). Малые мутации выявляют в результате математической обработки данных изменчивости изучаемого признака по семьям растений в третьем мутантном поколении (М 3). Благодаря малым мутациям создается огромная наследственная изменчивость различных признаков в популяциях растений, что имеет большое значение в селекции и эволюции вида. Крупные мутации, за редким исключением, не дают начала новым сортам и видам, потому что по причине низкой адаптации к внешним условиям удаляются естественным отбором.

От мутаций следует отличать морфозыили фенотипическое проявление признаков, которые являются одной из форм ненаследственной индивидуальной изменчивости организма, поэтому в последующих поколениях они не проявляются.

Для получения хозяйственно-ценных мутаций облучают от 2 до 4 тысяч семян. Отбор мутаций чаще всего проводят в М 2 . В связи с тем, что в М 2 выявляются не все мутации, отбор проводят и в М 3 . Иногда отбор мутаций начинают проводить в М 1 , при этом отбирают доминантные мутации по интересующему признаку (например, высокопродуктивные растения) для последующего отбора всех полезных мутаций. Для ускорения и облегчения выделения полезных мутаций все выделенные в М 1 растения высевают как индивидуальные потомства отдельных растений (семьи) для получения второго мутантного поколения. В М 2 отбирают мутанты с хорошо выраженными хозяйственно-ценными признаками и растения для получения малых мутаций в М 3 . В дальнейшем из ценных мутантов формируются новые улучшенные популяции, их используют в селекции (при скрещивании друг с другом или с другими сортами). Эффективность селекции повышается при обязательном экологическом испытании мутантов.

Радиационная селекция, как метод получения новых ценных сортов сельскохозяйственных растений и высокопродуктивных штаммов микроорганизмов, широко используется в практике. Радиационная селекция в растениеводстве включает два этапа :

1) использование ионизирующего излучения для получения селекционно-ценных мутантных форм растений, которые используются в дальнейшем в селекционном процессе в качестве исходного материала;

2) включение мутантных форм растений в селекционную работу по созданию новых сортов, обладающих селекционно-ценными признаками мутантных форм.

Для получения мутантов в растениеводстве используют рентгеновское излучение и гамма-излучение, нейтронное излучение (быстрые нейтроны – 0,2-26 МэВ и медленные нейтроны – 0,025 МэВ) и радиоактивные изотопы (фосфор-32 и серу-35) и др. Вероятность возникновения мутаций при облучении различных биологических объектов возрастает с увеличением поглощенной дозы. Однако, с увеличением дозы возрастает и гибель особей в облученной популяции, при этом многие возникшие мутации не выявляются. При радиационной селекции растений часто используют дозы, при которых погибает 70 % растений. Эти дозы называются критическими . У 30 % выживших растений можно наблюдать большое количество мутаций различного характера. Наиболее часто хозяйственно ценные мутанты образуются при меньших дозах облучения, при которых погибает только 20-30 % растений. Величина дозы облучения зависит от радиочувствительности биологических объектов. Например, дозы облучения семян рентгеновским и гамма-излучением для выхода полезных мутаций у пшеницы, ячменя и кукурузы составляют 50- 100 Гр, у овса – 70-100 Гр, у люпина – 140-160 Гр.

Под действием ионизирующего излучения возникают генные (или точечные) мутации и хромосомные мутации (или геномные мутации) . Геномные мутации , сопровождающиеся уменьшением количества хромосом (анеуплоидия) и увеличением количества хромосом (полиплоидия) в 2 или 4 раза наблюдаются редко. Анеуплоидные формы растений имеют резкие морфологические дефекты и не представляют интереса для радиационной селекции. Полиплоидные формы растений несут летальные мутации, поэтому погибают. Для селекционной работы жизнеспособные полиплоидные формы растений получают с использованием метода химического мутагенеза, при этом в качестве мутагенного препарата часто используют колхицин. Для радиационной селекции наибольший интерес представляют генные мутации. Следует напомнить, что ген – это определенный участок молекулы ДНК. Генные мутации индуцируются в пуриновых и пиримидиновых основаниях молекулы ДНК при ее радиолизе, что приводит к изменению генетического кода и, в конечном итоге, к появлению новых признаков, сформированных под действием облучения. В образовании мутаций немаловажную роль играют также процессы репарации одиночных разрывов молекулы и процессы репарации повреждений оснований.

Выход радиационных мутаций зависит от величины дозы облучения, мощности дозы облучения, вида излучения и величины линейной передачи энергии (ЛПЭ) и от стадии онтогенеза растений. Частота возникновения мутаций возрастает пропорционально дозе облучения. Однако, с увеличением дозы увеличивается частота хромосомных аберраций и гибель клеток, поэтому возникшие мутации не выявляются. Абсолютная величина дозы зависит от радиочувствительности конкретного облучаемого организма. Часто хозяйственно полезные мутанты растений образуются при облучении семян дозой, вызывающей гибель 20-30 % растений.

Возникновение мутаций, как и любого радиобиологического эффекта, – это многостадийный процесс, в котором участвуют, с одной стороны, вещества, повышающие выход мутаций, а, с другой стороны, ферменты репарации, снижающие выход мутаций. При большой мощности дозы облучения образуется больше мутаций, потому что при малой мощности дозы уже в процессе облучения успевают произойти репарационные процессы. При хроническом облучении развивающихся растений (при малой мощности дозы), растения облучаются в разных по радиочувствительности фазах развития, поэтому спектр мутаций разнообразнее, или при облучении растений в конкретной стадии развития высокой мощностью дозы. С уменьшением мощности дозы снижается количество хромосомных нарушений, поэтому уменьшается гибель клеток и растений.

Установлено, что при облучении излучением с низкой ЛПЭ (рентгеновское и гамма-излучение), большинство хромосомных повреждений восстанавливаются. Среди мутантных растений выявляют формы с признаками устойчивости к болезням, повышенного содержания ценных веществ. Излучения с высокой ЛПЭ (нейтроны) вызывают более глубокие нарушения в хромосомах, которые не восстанавливаются, поэтому у выживших мутантных растений выявляются многообразные нарушения морфологических признаков.

Выход и качество мутаций зависит не только от физических свойств излучений, но и от состояния генома как в момент облучения, так и в пострадиационный период окончательного формирования мутации. В радиационной селекции растений наиболее часто облучают покоящиеся воздушно-сухие семена растений. Облучение семян в различные периоды формирования, начиная с момента образования оплодотворенной семяпочки и до состояния глубокого покоя, дает неидентичные результаты. Частота и эффективность мутаций значительно возрастает при облучении растений в период слияния половых гамет и образования зиготы, в фазе завершения формирования зародыша и в фазе усиления ростовых процессов зародыша при прорастании семени.

Для получения мутантных растений используют метод облучения пыльцы в период ее созревания с последующим искусственным опылением необлученных растений облучаемой пыльцой.

Хозяйственно полезные мутанты растений, сочетающие высокую продуктивность с другими признаками, появляются, как правило, очень редко. Селекционно-ценные мутантные формы растений выделяются содержанием питательных веществ, скороспелостью, устойчивостью к болезням, устойчивостью к полеганию, повышенной продуктивностью и другими признаками. Мутантные формы используются в качестве донора полезного признака в селекции растений . На основе радиационного мутагенеза в растениеводстве решаются вопросы получения новых сортов сельскохозяйственных растений, которые характеризуются высокой урожайностью, устойчивостью к неблагоприятным условиям среды и действию патогенных вредителей. Селекционеры, используя мутагенный эффект, гамма-облучения почти в 5 раз сокращают сроки выведения новых сортов зерновых культур.

К настоящему времени зарегистрировано более 1000 сортов различных растений, созданных с использованием мутантных форм растений, полученных при использовании ионизирующих излучений. Больше всего таких сортов получено у ячменя (72 сорта), риса (65 сортов), пшеницы (38 сортов), фасоли (10 сортов), арахиса (15 сортов), в которых сочетается высокая урожайность и улучшенное качество зерна с высокой экологической пластичностью. У декоративных растений получено более 500 радиационных мутантов, отличающихся прекрасными декоративными формами, устойчивостью к болезням и хорошей адаптационной способностью к неблагоприятным факторам внешней среды.

В микробиологической практике обычно используют дозы, при которых остается 1-5 % выживших микроорганизмов. Радиационным методом был получен штамм микроорганизма для производства молочного порошка нислактин, при добавлении которого к плавленым сырам улучшается их качество и продлевается срок хранения. Нислактин используют в кормовых добавках при вскармливании поросят, при этом повышается прирост массы поросят и улучшается их общее состояние. Методом радиационной селекции были получены новые формы микроорганизмов, которые являются возбудителями заболеваний у ряда вредителей сельскохозяйственных культур. Например, был получен возбудитель мускардиноза для более 60-ти видов насекомых-вредителей (яблоневой плодожорки, хлебного клопа-черепашки, фасолиевой зерновки и др). Особый интерес и практическую ценность при радиационных мутациях микроорганизмов представляют генные мутации, которые косвенно влияют на деятельность ферментов. При этом фермент активизируется, и реакции, катализируемые этим ферментом, проходят интенсивнее, чем в норме, поэтому у микроорганизмов усиливается продукция того и иного метаболита – антибиотиков, аминокислот и др.

При облучении культуры дрожжей были получены расы, вырабатывающие в 2 раза больше эргостерина, что имеет большое значение для витаминной промышленности.

Комбинированным воздействием радиации и химических мутагенов получено много штаммов высоко активных плесневых грибов, которые вырабатывают пенициллин, стрептомицин, ауреомицин, эритромицин и альбомицитин. Некоторые штаммы плесневых грибов дают выход стрептомицина в 20, а пенициллина в 50 раз больше исходных рас. Производство антибиотиков промышленным способом значительно расширило их доступность для населения.

Еще в 1935 г. А.Н. Лутков - ближайший коллега известного в нашей стра-

не генетика-селекционера Г.Д. Карпеченко - опубликовал статью «Мутации и их значение для селекции». В ней автор подвел итоги длительных дискуссий среди биологов и генетиков о роли мутаций в эволюции и селекции и суммировал накопившиеся к этому времени факты по экспериментальному получению мутаций у растений.

В основу статьи была положена работа известного американского генетика Германа Мёллера (Нобе-

левская премия по физиологии и медицине, 1946)), который экспериментально доказал возможность возникновения искусственных мутаций под дейст-

вием рентгеновских лучей (1927) и последовавшие за этим открытием работы исследователей многих стран по получению мутационных изменений с по-

Г. Мёллер (1890-1967) мощью воздействия на геном растений различными физическими и химическими факторами.

С послевоенного времени и до середины 60-х годов XX века работа с экспериментальными мутациями у нас в стране практически не велась вследствие административного запрета на занятие классической генетикой, которая официально была признана лженаукой.

Мутагенез позволил создать большие коллекции мутантных растений, открыл новые возможности для решения многих фундаментальных проблем биологии растений. Например, благодаря созданию коллекции хлорофильных мутаций были изучены основные стадии синтеза хлорофилла и основные пути фотосинтетических реакций. Значительные успехи были достигнуты и в практической селекции. За 20-25 лет интенсивных работ в области экспериментального мутагенеза в бывшем СССР были созданы несколько сотен сортов растений с использованием мутантных генов. Между тем с помощью индуцированных мутаций создано лишь

небольшое число сортов у основных сельскохозяйственных растений - зерновых,

овощных и плодовых.

Более успешно метод экспериментального мутагенеза использован в декоративном цветоводстве и садоводстве для получения оригинальных форм растений. Разумеется, метод мутагенеза не мог полностью заменить традиционные методы селекции, базирующиеся на гибридизации, рекомбинации и отборе, или конкурировать с ними, но он был чрезвычайно важен для развития общей теории генетики и селекции растений и дополнил арсенал методов улучшения культурных растений (Малецкий С.И., 2002).

По даннымБ.Н. Анненкова и Е.В. Юдинцевой (1991) в настоящее время радиационный мутагенез стал одним из прогрессивных методов получения разнообразных генетических мутаций для последующего отбора и выведения новых сортов. Он позволяет получать формы, обладающие повышенной урожайностью, устойчивостью к заболеваниям и неблагоприятным факторам внешней среды, повышенным выходом биологически активных и питательных веществ в урожае. С использованием ионизирующей радиации к настоящему времени в мире уже получено более 150 сортов различных сельскохозяйственных культур. Например, высокоурожайная и устойчивая к полеганию пшеница Новосибирская 67 , вилтоустойчивый сорт хлопчатника АН-402 и др.

Облучению гамма-лучами и нейтронами чаще всего подвергаются семена или пыльца растений. При этом частота мутаций возрастает более чем в 200 раз. Мутации затрагивают урожайность, скороспелость, засухо- и зимостойкость, размеры самих растений и ряд других признаков.

У подавляющей части полученных мутантов преобладают угнетенные нежизнеспособные особи. Поэтому на втором этапе на основе отобранных форм с улучшенными селекционными признаками проводится дальнейшая селекция по выведению, испытанию, генерации и внедрению в практику нового сорта.

Ценность используемого в селекции растений радиационного мутагенеза состоит еще и в том, что среди мутантов появляются формы с новыми признаками, не встречавшимися в природе. При этом характер и получаемое число мутантов во многом определяются состоянием исходного материала и, в частности, исходного сорта.

Наиболее мутабильными оказались относительно молодые сорта и сложные гибридные формы. Старые сорта являются очень стойкими. Кроме того, выход и качество мутаций зависят от состояния генома в момент облучения и в послерадиационный период окончательного формирования мутации. Под геномом понимают совокупность генов, содержащихся в гаплоидном наборе хромосом данной клетки.

В радиационной генетике часто используется метод облучения покоящихся воздушно сухих семян. В этом случае на количество и качество мутаций влияют условия хранения и проращивания семян. Как правило, при малой влажности изменчивость возрастает. То же происходит при облучении незрелых семян. Так, при облучении незрелых семян гороха дозой 5 кР количество мутантов возрастало в 3 раза по сравнению с облучением полностью созревших.

На величину мутагенеза влияет также и период вегетации. Установлено, что при облучении бобовых культур наибольшее число ценных в хозяйственном отношении мутаций получается в фазе бутонизации.

Образование мутаций зависит от условий самого облучения: дозы, мощности и вида ионизирующего излучения. Вероятность мутагенеза возрастает с увеличением поглощенной дозы, однако при этом в популяции гибнет и большая часть растений и вследствие этого большая часть мутаций не выявляется. При большой мощности дозы облучения наблюдается высокий выход мутаций, тогда как при малой дозе в процессе облучения в растении успевают проходить репарационные процессы.

На практике чаще используют различные виды излучений как с малой (рентгеновское и гамма), так и с высокой плотностью ионизации (нейтронное). При этом первые в меньшей степени затрагивают хромосомный аппа-

рат, а вторые вызывают в нем серьезные нарушения, не поддающиеся репа-

В связи с этим меняется и сам спектр возникающих мутаций. Так, нейтронное облучение вызывает появление большого числа короткостебельных форм с плотным колосом у пшеницы и ржи. А облучение рентгеновскими и гамма-лучами вызывает у полученных форм увеличение резистентности к ряду заболеваний. При высоких дозах быстрые нейтроны увеличивают частоту хлорофильных мутаций во втором поколении в сравнении с рентгеновскими лучами в десятки раз.

Условия выращивания растений из облученных семян позволяют не только увеличить уровень изменчивости, но и сместить спектр получаемых мутаций. В числе таких факторов находятся температура, длительность светового дня условия корневого питания, почвенно-климатические условия. При резком колебании указанных факторов изменчивость возрастает.

Метод радиационного мутагенеза позволяет значительно сократить время выведения конкретного сорта. Только этому селекционному приему присуща способность изменять один какой-либо нуждающийся в коррекции признак без изменения всего комплекса положительных свойств и качеств.

Индуцированные мутации, вызванные облучением, впервые были получены советскими учеными Г. А. Иадсоном и Г. С. Филипповым, которые в 1925 г. наблюдали мутационный эффект на дрожжах после воздействии на них радиевыми лучами. В 1927 г. американский генетик Г. Меллер показал, что рентгеновы лучи могут вызвать множество мутаций у дрозофилы, а позже мутагенное действие рентгеновых лучей подтвердилось на многих объектах. В дальнейшем было установлено, что наследственные изменения вызываются также всеми другими видами проникающей радиации. Для получения искусственных мутаций часто используются гамма-лучи. В последнее время для индуцирования мутаций все шире применяются нейтроны, обладающие большой проникающрй способностью. При этом возникают как разрывы хромосом, так и точковые мутации. Изучение мутаций, связанных с действием нейтронов и гамма-лучей, представляет особый интерес по двум причинам. Во-первых, установлено, что генетические последствия атомных взрывов связаны прежде всего с мутагенным влиянием ионизирующей радиации. Во-вторых, физические методы мутагенеза используются для получения ценных в хозяйственном отношении сортов культурных растений. Так, советские исследователи, используя методы воздействия физическими факторами, получили стойкие к ряду грибковых заболеваний и более урожайные сорта пшеницы и ячменя.

Общая закономерность: с увеличением дозы - увеличивается степень повреждения системы; в процесс вовлекается все большее число составляющих её элементов. В зависимости от действующей дозы практически всякое вещество в определенных условиях может оказаться вредным для организма. На проявление зависимости "доза-эффект" оказывает существенное влияние внутри- и межвидовая изменчивость организмов. Действительно, особи, относящиеся к одному и тому же виду, существенно отличаются друг от друга по биохимическим, физиологическим, морфологическим характеристикам. Эти отличия в большинстве случаев обусловлены их генетическими особенностями. Еще более выражены, в силу тех же генетических особенностей, межвидовые различия. В этой связи дозы конкретного вещества, в которых оно вызывает повреждение организмов одного и того же и, тем более, разных видов, порой очень существенно различаются. Следовательно, зависимость "доза-эффект" отражает свойства не только токсиканта, но и организма, на который он действует. На практике это означает, что количественную оценку токсичности, основанную на изучении зависимости "доза-эффект", следует проводить в эксперименте на различных биологических объектах, и обязательно прибегать к статистическим методам обработки получаемых данных.

В настоящее время общепринято, что за передачу наследственных признаков организма отвечает дезоксирибонуклеиновая кислота - ДНК, в которой четыре основания - тимин, аденин, цитозин, гуанин расположены в определенной последовательности. Согласно этой теории изменение последовательности этих оснований в молекуле ДНК - так называемого кода или их химической структуры приведет к изменению наследственности организма.

В результате проведенных многими авторами экспериментов было установлено, что при воздействии на клетку реагентами - химическими веществами или различными излучениями можно вызвать появление новых признаков у растительных организмов, так называемых мутаций. Они могут возникать в живом организме и спонтанно. В этом случае наиболее вероятными причинами возникновения мутаций являются изменения в физиолого-биохимических процессах, протекающих в самой клетке. Они обычно вызываются в результате изменений внешних условий. Исследования спонтанного мутагенеза показали, что все характерные для него закономерности можно применить и для индуцированного мутагенеза.

Одним из перспективных методов получения искусственных мутаций является радиационный. Радиационная селекция дает возможность в течение относительно коротких сроков получать значительное количество полезных мутантов - примерно около 20% от общего количества новых форм. Кроме того, радиационные излучения дают возможность влиять на отдельные признаки целого растения, не изменяя других, хозяйственно полезных, чего невозможно достигнуть никакими другими методами.

Основоположниками радиационной генетики считаются Г.А. Надсон, Г.С. Филиппов, которые в 1925 г. изучали воздействие ионизирующих излучений на наследственную изменчивость дрожжей.

В 1930 г. в нашей стране наметился активный рост исследований в области получения радиомутантов целого ряда сельскохозяйственных культур. Так, А.А. Сапегин, Л.Н.Делоне провели серию фундаментальных работ по селекции пшеницы. Ими также были освещены некоторые вопросы зависимости мутаций от мощности доз облучения, физиологического состояния организма перед облучением и т.д. Возник вопрос о радиомутабельности различных видов растений, о частоте мутаций отдельных генов. А. Н. Лутковым было установлено, что при γ-облучении наиболее часто отмечаются мутации у генов, регулирующих развитие вегетативных органов, меньше подвергались изменению гены, ответственные за формирование органов цветка.

Большие теоретические разработки в проблеме гена и структурных нарушений хромосомного аппарата в результате воздействия на клетку радиоизотопом выполнены А.С. Серебровским и Н.П. Дубининым.

Активно начатые у нас в стране исследования по радиационной генетике к 1940 г. были практически прекращены. Целые школы генетиков и селекционеров были изгнаны из науки в результате деятельности Т.Д. Лысенко.

В этот период за границей, особенно в Швеции, США, Японии и других странах, были созданы новые, оснащенные современной техникой научно-производственные объединения. Результаты, полученные ими, были весьма значительными. Выведенные новые сорта и гибриды многих сельскохозяйственных культур давали большие прибавки урожая, были более стойки к заболеваниям, технологичны в производстве.

Все это привело к тому, что в начале - середине 50-х годов и в СССР официально была признана теория генной наследственности, а ее сторонники И.П. Дубинин, П.К. Шкварников, С.С. Алиханян, А.М. Кузин и другие получили возможность возобновить свои исследования по решению проблем радиационной генетики и селекции, изучению вопросов влияния различных источников радиации на клетку, как основу и первопричину всех последующих изменений организма.

В 1960-х г.г. ведущими странами уже было выпущено 7 сортов мутантного происхождения, в 1970 - 80, в 1975 г. - около 120, а в настоящее время зарегистрировано более 200 сортов разных культур, имеющих больше хозяйственно-ценных свойств по сравнению с ранее известными сортами. Таких значительных результатов иностранные исследователи добились в немалой степени не только за счет использования одного радиационного мутагенеза, но и его рационального сочетания с химическим мутагенезом. Они развивали оба эти направления, не противопоставляя их друг другу, а взаимообогащая, и это несмотря на то что приоритет химического мутагенеза принадлежит нашим отечественным исследователям - В. В. Сахарову, К. Ф. Магржиковской, В. П. Пономареву, И. А. Рапопорту и др.

Главная цель радиационной селекции - получение большого разнообразия

искусственных мутантов, что недостижимо ни в естественных условиях, ни при применении

химических мутагенов. При радиационном мутагенезе большая часть появившихся признаков

являются неблагоприятными. Часто в результате радиационного воздействия появляются

химерные (уродливые) и угнетенные формы. Однако благодаря дупликациям (изменение

хромосомы, при котором один из её участков линейно представлен два или более раз)

существует определенная вероятность возникновения полезных признаков, таких как высокая

урожайность, измененный химический состав (например, повышенное содержание белка),

скороспелость, устойчивость к полеганию, холоду и высокой температуре, болезням и т. д

(Фокин и др., 2005).

Для получения растений-мутантов требуются сравнительно высокие дозы излучений. В

радиационной генетике, кроме летальной, различают критическую дозу облучения.

Критической называют такую дозу, при которой наблюдается сильное угнетение организмов, но

значительная часть их все-таки выживает и дает большое число мутаций. Ядро клетки более

чувствительно к облучению, чем цитоплазма. Оно может поражаться при дозе, равной всего

нескольким рентгенам, в то время как цитоплазма способна выносить большие дозы. Различие

в радиочувствительности ядра и цитоплазмы может достигать величины 100 000 раз и более.

(Гуляев, 1984). В настоящее время критические дозы установлены более чем для 150

культурных и многих видов диких растений. Критические дозы их колебались от 400 до 200

000Р (Табл. 5).

Как правило, большее количество мутаций удается получить при сублетальных дозах -

дозах, вызывающих гибель примерно у 50 и даже 70% растений. Обычно проявляется

следующая закономерность: чем выше доза, тем большее число мутаций появляется, но при

этом гибель организмов выше. При малых дозах процессы репарации успевают пройти еще во

время облучения и появление мутаций маловероятно; при больших дозах, наоборот, вещества,

индуцирующие изменения, превалируют над репарационными ферментами.Для получения мутаций облучению подвергают семена, пыльцу, проростки, различные

органы растения (в том числе и репродуктивные) на разных этапах органогенеза или целые

растения. Чаще используют облучение семян. Важные факторы лучевого воздействия - вид

излучения, доза и ее мощность, фаза развития растений или состояние семян. При внутреннем

облучении семян их замачивают в растворах радиоактивных веществ. Мутации получают и при

выращивании растений в вегетационных сосудах на питательной среде с добавлением

радионуклидов. Для облучения обычно используют излучения короткоживущих радиоизотопов.

Мутанты, обладающие хозяйственно-полезными свойствами возникают редко. В

большинстве случаев они не являются готовыми сортами, а представляют лишь исходный

материал для селекции. Возможны два основных пути селекционного использования

искусственных мутаций:

· прямое использование мутаций, полученных у самых лучших районированных сортов;

· использование мутаций в процессе гибридизации.

В первом случае ставится задача улучшения существующих сортов по некоторым

хозяйственно-биологическим признакам, исправление у них отдельных недостатков. Этот метод

считается перспективным в селекции на устойчивость к заболеваниям. Метод прямого

использования мутаций рассчитан на быстрое создание исходного материала с нужными

признаками и свойствами. Однако, при высоких требованиях, предъявляемых к современным

селекционным сортам, этот метод достаточно редко дает нужные результаты. Полученный

вследствие мутагенеза исходный материал, как правило, используется в процессе

гибридизации.

Таким образом, создание новых сортов культурных растений под воздействием

ионизирующего излучения складывается из двух этапов. На первом этапе индуцируется

появление максимально возможного количества видоизмененных растений. Второй этап - это

создание новых сортов растений обычными методами традиционной селекции. На разных

этапах онтогенеза могут появляться различные мутации, которые в последующем могут

оказаться благоприятными. В первом поколении, как правило, появляются химерные

(уродливые) формы, более точное представление о выходе мутаций дает второе поколение.

При выращивании перекрестноопыляющихся растений из облученных семян в первом

поколении необходима их строгая изоляция от других растений для предотвращения опыления;

в противном случае мутацию легко утерять.

Частоту и спектр мутаций, индуцируемых определенными мутагенами у данного

объекта, можно существенно менять, т.е. модифицировать. Это достигается путем изменения

режима мутагенной обработки или применения до, во время или после воздействия некоторых

некоторых растений было установлено, что эффект ионизирующей радиации в сильной степени

зависит от того, в присутствии кислорода или без него оно проводится. Оказалось, что

бескислородная среда является защитным средством против ионизации, облучение же в

атмосфере чистого кислорода резко увеличивает процент мутаций (кислородный эффект).

Оказалось, что и после облучения повышение в среде кислорода усиливает повреждающий

эффект ионизации, в то время как в бескислородной среде заметно ослабляется (Гуляев, 1984).

В настоящее время более 1000 разновидностей культурных растений, полученных

методом индуцированных мутаций, выращивают по всему миру на площади в несколько

миллионов гектаров. Методами радиационной селекции получено значительное число новых

ценных сортов зерновых и других культур - горчицы, рапса, томатов, декоративных культур. В

ряде стран выращиваются высокоурожайный горох и ячмень, дающий прочную соломину.

Выведен высокоурожайный, устойчивый к заболеванию ржавчиной, неполегающий овес с

коротким стеблем. Получены формы пшеницы и ячменя с высокой сопротивляемостью к__стеблевой и листовой ржавчине. В нашей стране получены хозяйственно ценные мутанты у

пшеницы: неполегающие, более продуктивные, с повышенным содержанием белка, устойчивые

к грибным заболеваниям формы (Файтельберг-Бланк и др., 1974).