Описание

Метод определения Иммуноблот.

Исследуемый материал Сыворотка крови

Доступен выезд на дом

Антинуклерные антитела представляют семейство аутоантител, связывающихся с рибонуклеиновыми кислотами и ассоциированными с ними белками. Они встречаются более чем у 90% больных с диффузными болезнями соединительной ткани, а также часто отмечаются при аутоиммунных заболеваниях печени и ряде других состояний. На сегодняшний день охарактеризованы около 200 разновидностей этого семейства аутоантител, но не все они могут быть использованы в клинической практике.

Иммуноблот антинуклеарных антител позволяет в одном тесте одновременно провести исследование 15 основных разновидностей антинуклеарных антител, что обеспечивает проведение дифференциальной диагностики основных системных ревматических заболеваний. Каждая разновидность аутоантител, выявляемая с помощью иммуноблота, обычно отмечается у пациентов с характерной клинической картиной, поэтому спектр аутоантител позволяет не только диагностировать заболевание, но и установить риск развития определенных клинических проявлений.

Иммуноблот антинуклеарных антител целесообразно использовать на втором этапе серологического обследования при положительном результате других тестов, указывающих на присутствие в сыворотке обследуемого антинуклеарных антител. К таким тестам относятся определение антиядерных антител (скрининг ИФА ), выявление антинуклеарного фактора (АНФ) на клетках Hep2 (), антинуклеарных антител и антител к экстрагируемому ядерному антигену (ЭНА, ).

Метод иммуноблота антинуклеарных антител в диагностике системных ревматических заболеваний характеризуется высокой клинической специфичностью. Но специфику антинуклеарных антител даже при высоких титрах АНФ () удается установить не всегда, поскольку до сих пор остаются неохарактеризоваными ряд антигенов антинуклеарных антител. Отрицательный результат иммуноблота в этом случае не исключает диагноза системных ревматических заболеваний. Ряд антинуклеарных антител можно выявить с помощью иммуноблота - панель миозит-специфичных аутоантител () и иммуноблота - панель аутоантител при склеродермии ().

Литература

1. Лапин С.В. Тотолян А.А. Иммунологическая лабораторная диагностика аутоиммунных заболеваний/ Издательство «Человек», СПб - 2010. 272 c.
2. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н. Современные стандарты лабораторной диагностики ревматических заболеваний. Клинические рекомендации / БХМ, М - 2006.
3. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Organ Specific Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2011. 300 p.
4. Conrad K, Schlosler W., Hiepe F., Fitzler M.J. Autoantibodies in Systemic Autoimmune Diseases: A Diagnostic Reference/ PABST, Dresden – 2007. 300 p.
5. Gershvin ME, Meroni PL, Shoenfeld Y. Autoantibodies 2nd ed./ Elsevier Science – 2006. 862 p.
6. Shoenfeld Y., Cervera R, Gershvin ME Diagnostic Criteria in Autoimmune Diseases / Humana Press – 2008. 598 p.
7. Инструкции к набору реагентов.

Подготовка

Предпочтительно выдержать 4 часа после последнего приема пищи, обязательных требований нет.

Показания к назначению

Тест показан для диагностики и дифференциальной диагностики следующих состояний:

• системная красная волчанка;
• подострая кожная волчанка и другие разновидности кожной волчанки;
• смешанное заболевание соединительной ткани;
• синдром Шегрена и ассоциированные заболевания;
• диффузная и локализованная склеродермия, CREST-синдром;
• воспалительные миопатии (полимиозит и дерматомиозит);
• ювенильный хронический артрит;
• аутоиммунный гепатит;
• первичный билиарный цирроз и склерозирующий холангит;
• использование данного теста показано при обнаружении высоких титров антинуклеарного фактора, антинуклеарных антител, антител к экстрагируемому ядерному антигену, антител к ДНК, антител к нуклеосомам и антифосфолипидных антител.

Интерпретация результатов

Интерпретация результатов исследований содержит информацию для лечащего врача и не является диагнозом. Информацию из этого раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. Точный диагноз ставит врач, используя как результаты данного обследования, так и нужную информацию из других источников: анамнеза, результатов других обследований и т.д.

Единицы измерения: качественный тест, результат представляют в форме «обнаружено» или «не обнаружено».

При обнаружении полосы, характеризующей наличие какого-либо вида антител, интенсивность окраски полосы дополнительно описывают количеством плюсов («крестов») для каждого из выявленных видов антител. Увеличение степени позитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител.

Референсные значения: антитела к Sm, RNP/Sm, SS-A (60 kДа), SS-A (52 кДа), SS-B, Scl-70, PM-Scl, PCNA, CENР-B, dsDNA, Histone, Nucleosome, Rib P, AMA-M2, Jo-1 не обнаружены.

Результат определения аутоантител представляется в «крестах» для каждого соответствующего антигена. Увеличение степени серопозитивности косвенно отражает содержание и аффинность аутоантител. Варианты результата оценки серопозитивности приведены ниже:

1. Антитела не обнаружены.
2. +/- - пограничный результат;
3. + – низкое содержание аутоантител к специфическому антигену;
4. ++ – среднее содержание аутоантител к специфическому антигену;
5. +++ – высокое содержание аутоантител к специфическому антигену.

Основные заболевания, связанные с выявлением антинуклеарных антител:

В практике лабораторной диагностики ин­фекционных заболеваний существует иногда не­обходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антиге­нам), то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод твердо­фазного иммуноферментного анализа, то в таком случае приходится предварительно из культуры патогена выделять и очищать необходимые анти­гены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-лу-ночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфичес­кие антитела непрямым методом.

По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном, можно судить о на­личии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, одна­ко широкое распространение, благодаря боль­шей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагнос­тически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая.

Ученый по фамилии Саузерн (Е. Southern) в 1975 году впервые предложил метод переноса электрофорети чески разделенных фрагментов ДНК из геля на мембрану. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе оз­начает «южный перенос». Метод переноса моле­кул РНК в свою очередь был специалистами прозван Northern blot - «северный перенос». Поначалу в шутку, а затем это название закре­пилось и в официальной научной литературе.

Г. Тоубин в 1979 году опубликовал результа­ты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» на­именований методов переноса биологических макромолекул данный метод стал именоваться «западным» переносом -Western blot.

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутст­вии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, яв­ляясь поверхностно активным веществом, равно­мерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от разме­ров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процеду­ры получают гелевую пластину, в толщине ко­торой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движе­ния они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой моле­кулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к фи­нишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и поме­шают эту конструкцию между электродами ис­точника постоянного тока. Под дей­ствием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирую­щим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержа­ла все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В коммерческих тест-системах для определе­ния антител методом иммунного блотинга содер­жатся уже готовые к исследованию блоты (по­лоски, или стрипы). Пользователь проводит оп­ределение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют раство­римое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нераствори­мым и оседает (преципитирует) на нитроцеллю­лозе.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при нали­чии в исследуемой пробе антител к белкам пато­гена на блоте появляются темные поперечные по­лоски, расположение которых находится в зоне оп­ределенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выяв­лены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Од­нако интенсивность окраски при этом значитель­но ослабевает. Влажные блоты можно фотогра­фировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональ­ных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать получен­ные результаты и оперативно отслеживать дина­мику спектра антител при динамическом наблю­дении

ИММУНОБЛОТ (western blot) - метод лабораторного исследования сыворотки крови на присутствие антител к ВИЧ; это более точный анализ, чем ИФА, и используется для подтверждения результатов ИФА. ИФА - иммуноферментный анализ (ELISA) -лабораторное исследование, позволяющее определить присутствие в крови ВИЧ-антител; тест на ВИЧ-антитела.

По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА . Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий (). Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется - делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120 , gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.

Для проведения иммуноблотинга на первом этапе белки, содержащиеся в сыворотке крови, разделяют в геле по их молекулярной массе и заряду с помощью электрического поля (методом электрофореза в геле). Затем на гель накладывают нитроцеллюлозную или нейлоновую мембрану и "промокают" (это и есть блоттинг). Это осуществляют в специальной камере, которая позволяет осуществить полный пернос материала из гела на мембрану. В результате та картина расположения белков, которая была на геле, воспроизводится на мембране (блот), с которой можно далее легко манипулировать. Первоначально мембрану обрабатывают антителами к искомому антигену, а после отмывки несвязанного материала, добавляют радиоактивно меченный коньюгат, который специфически связывается с антителами (как в ИФА). Местоположение образующегося комплекса антиген - антитело - меченый коньюгат определяют с помощью авторадиографии с использованием рентгеновской пленки. После ее проявления все становится ясным, есть антигены в крови или их нет.

Кровь забирают из вены. Затем исследование проходит по инструкции:

• образец помещают в гель для электрофоретического разделения, в результате получают специфические белки, чувствительные к вирусу;
• на обработанный гель накладывается нитроцеллюлозная бумага;
• подготовленный образец помещают в аппарат для блоттинга.

Чтобы выявить специфические ферменты, необходимо правильно подготовить бумагу для лабораторного исследования. Для этого на нее наносят антитела и меченый радиоактивный конъюгат. Результат исследования оценивают визуально, исследуют построенные цепочки ферментов.

Расшифровка результатов

После проведенных манипуляция на бумаге остаются полосы. Они располагаются там, где произошла конъюгация, то есть нанесенный препарат вступил в реакцию с протеином вируса. Таким образом можно обнаружить части белка:

• из сердцевины ВИЧ-1 – р17, р24, р55;
• возбудителя ВИЧ-2 – р16, р26, р56.

Результаты иммуноблоттинга считаются положительными, если обнаружено 2 из 3 протеина ВИЧ-1 или ВИЧ-2. Так как часто вестерн-блот (второе название исследования) используют для подтверждения положительного ИФА, то реакцию проверяют на специфические протеины: gp120/160, gp41 или р24. Они являются частью трех основных генов СПИДа – gag, pol, and env. При первичной диагностике проверка проводится только на белки р25, gp110/120 и gp160, если она дала положительный результат, то проверку проводят на р24. Эта часть белка позволяет обнаружить вирус на ранней стадии.

Положительный результат – повод обратиться за более сложной диагностикой. Он бывает ложным только в 3-х случаях:

• у пациентов с высоким уровнем билирубина;
• при контакте с вирусными антигенами;
• при патологиях соединительной ткани.

Если у пациента нет линий, соответствующих белкам СПИДа, то результат оценивают как отрицательный. Это означает, что человек не заражен ВИЧ или он находится в «периоде окна». Последнее означает, что вирус мог попасть в организм, но еще не развиться в нем. Чтобы повысить точность диагностики, используются тест-системы:

• Рекомбинат-ВИЧ;
• Антиген;
• Пептоскрин.

После проверки на них результат засчитывается за отрицательный, если в образце не найдены белки gp120, gp160, Sp4.

Есть еще один вариант интерпретации – нейтральный или сомнительный результат. Он встречается у тех, кто вступил в сексуальный контакт с ВИЧ-инфицированным партнером. В их крови находят антитела к белкам gp120 и gp160. Также сомнительный ответ при блоттинге дают, когда инфекция протекает бессимптомно, то есть находится в спящем состоянии.

Сомнительный результат важно подвергнуть тщательной проверке. Для этого используют исследование сыворотки крови в динамике, то есть регулярные проверки методами иммунноблоттинга и ИФА в течение полугода. Также назначаются дополнительные обследования, так как присутствие в крови аутоантител и иммунных комплексов может быть обусловлено:

• инфекционными заболеваниями;
• наличием раковых опухолей;
• аллергией.