Фибробласты - это что такое? Клеточное омоложение фибробластами. Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека Преимущества восстановительных биотехнологий

Владельцы патента RU 2536992:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа с получением банка рабочих клеток 16 пассажа. При этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Изобретение позволяет повысить пролиферативную активность диплоидных клеток фибробластов человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии, медицине, в частности к способу повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для использования таких клеток в лечебных и диагностических целях, в том числе для определения антивирусной активности интерферонов человека, для заместительной клеточной терапии.

Линии диплоидных клеток человека (ЛДКЧ) обладают неоспоримыми преимуществами перед всеми известными видами клеточных культур своей способностью сохранять в пассажах стабильные биологические и генетические характеристики. Аттестацию ЛДКЧ, предназначенных для производства вакцин, проводят в соответствии с едиными требованиями, разработанными Всемирной организацией здравоохранения . Эти рекомендации взяты за основу национальных критериев аттестации вакцинных ЛДКЧ, разработанных ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича и МЗ СССР [Методические рекомендации «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» РД-42-28-10-89. МЗ СССР. М., 1989. - С. 16]. Аттестованная линия диплоидных клеток человека имеет ограниченный срок жизни и обладает стабильными биологическими, культуральными и генетическими характеристиками, она свободна от контаминантов (бактерий, грибов, микоплазм, вирусов) и не вызывает образования опухолей у иммуносупрессированных животных. Линия диплоидных клеток должна иметь аттестованный банк посевных клеток на ранних уровнях пассажей (до 10 пассажа), состоящий не менее чем из 200 криопробирок. При пассировании посевных клеток из одной или нескольких криопробирок до уровня 16 пассажа получают рабочий банк клеток, из которого могут быть получены необходимые культуры-продуценты для производства или для исследовательской работы. В России и за рубежом существуют всего несколько линий диплоидных клеток человека (Wi-38, MRC-5, М-22 и др.), аттестованных согласно перечисленным требованиям. Аттестованные ЛДКЧ используют при изгототовлении вакцин против полиомиелита, кори, краснухи, бешенства, респираторной и цитомегаловирусной инфекций, а также интерферона [Т.К. Борисова, Л.Л. Миронова, О.И. Конюшко, В.Д. Попова, В.П. Грачев, Н.Р. Шухмина, В.В. Зверев. Отечественные штаммы диплоидных клеток человека - субстрат для производства вакцин. Медицинская вирусология. Материалы научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии, посвященной 100-летию М.П. Чумакова». М. 2009. Том XXVI. С. 305-307; Л.Л. Миронова, В.Д. Попова, О.И. Конюшко. Опыт создания банка авторских линий перевиваемых клеток и их применение в вирусологической практике. Биотехнология. 2000, с. 41-47]. ЛДКЧ широко применяются in vitro для диагностики вирусных инфекций, анализа токсичности различных препаратов и изделий, для заместительной терапии [Патент РФ №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова; С.В. Смирнов, В.Б. Хватов. Инновационные технологии местного лечения ожогов в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В книге: Новая экономика. Инновационный портрет России. М., Центр стратегического партнерства, 2009. С. 388-390].

В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 80-х годах 20 века было установлено несколько линий диплоидных клеток из кожи и мышц 8-10 недельных эмбрионов человека. Настоящая работа посвящена модификации производства диплоидных клеток человека для диагностических целей и заместительной клеточной терапии, а именно получению диплоидных клеток фибробластов человека с повышенными пролиферативными свойствами.

Прототип. Патент РФ №1440029 от 22.03.93 г. [Миронова Л.Л., Преображенская Н.К., Соловьева М.Н., Орлова Т.Г. Стобецкий В.И., Крючкова Г.П., Кармышева В.Я., Кудинова С.И., Попова В.Д., Алпатова Г.А. ИПВЭ и НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи. Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека, используемый в качестве тест-системы для определения антивирусной активности интерферонов человека и размножения вирусов].

Этот штамм ЛДКЧ обозначен М-21, однако культура фибробластов М-21 обладала недостаточной пролиферативной активностью, что снижало время образования монослоя и повышало расход клеток и материалов, и это, в конечном итоге, привело к полному истощению ее запасов. В результате возникла необходимость в новой клеточной линии, пригодной для определения антивирусной активности интерферонов человека и других медико-биологических целей, более экономически выгодной, отличающейся высокой пролиферативной активностью, имеющей банки посевных и рабочих клеток. Эта линия обозначена М-20. На уровне 7 пассажа изготовлен банк посевных клеток. В 2012 году из ампулы банка 7 пассажа изготовлен банк рабочих клеток на уровне 16 пассажа. Банки посевных и рабочих клеток на уровнях 7 и 16 пассажей хранятся в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН и позволяют обеспечить как производственные процессы, так и научные исследования.

Отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога (прототипа) является повышение пролиферативной активности клеток линии М-20 при использовании 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП).

Таким образом, объектом изобретения является способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека для медико-биологических целей посредством культивирования клеток из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, в котором используют диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20, которые масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека. При культивировании клеток используют, предпочтительно, питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.

Диплоидные клетки человека охарактеризованной линии М-20, получаемые вышеуказанным способом, обладают высокой пролиферативной активностью и пригодны для использования в лечебных и/или диагностических целях.

Схема осуществления способа:

1. Используется одна криопробирка из банка посевных клеток 7 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

2. Приготовление банка рабочих клеток на уровне 16 пассажа ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

3. Восстановление фибробластов линии М-20 из банка рабочих клеток 16 пассажа (ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН).

4. Получение монослойной культуры фибробластов линии М-20, 17 пассаж.

5. Восстановление биологических свойств фибробластов линии М-20 путем трехкратного пассирования (до 20 пассажа включительно) для репарации возможных повреждений ДНК в процессе криоконсервирования.

6. Получение культур клеток для диагностических целей и заместительной клеточной терапии тиражированием фибробластов линии М-20 с 20 по 33 пассаж с использованием питательной среды, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл).

Предлагаемый способ обеспечивает получение клеток, обладающих высокой пролиферативной активностью и пригодных для использования в диагностических и/или лечебных целях.

Данный технический результат достигается культивированием фибробластов человека линии М-20 в питательной среде с добавлением 10 % фибринолитически активной плазмы (ФАП), обладающей ростстимулирующим действием и обеспечивающей усиление пролиферативной активности культуры клеток.

ФАП - клинически используемая трансфузионная среда, которую получают из крови внезапно умерших от инфаркта миокарда, острой сердечной недостаточности, кровоизлияния в головной мозг, в первые 6 часов после смерти [приказ МЗ СССР №482 от 14.06.1972 года «Об улучшении обеспечения лечебно-профилактических учреждений и клиник трупными тканями, костным мозгом и кровью»]. Посмертная кровь является полноценной трансфузионной средой, имеющей ряд биологических свойств - в первую очередь повышенный фибринолитический потенциал. В этой связи посмертную кровь предложено также называть фибринолизной. Основные показания к переливанию посмертной крови: острая кровопотеря, шок, анемия различного происхождения, ожоговая травма, обменное замещение при экзогенных отравлениях, заполнение АИКа при использовании экстракорпорального кровоообращения в хирургии [Е.Г. Цуринова. Переливание фибринолизной крови. М., 1960, 159 с; С.В. Рыжков. Заготовка и возможности использования фибринолизной крови в зависимости от срока взятия и причины смерти. Автореф. докт. дисс. Л., 1968, 21 с.; Г.А. Пафомов. Биологическая характеристика крови внезапно умерших и ее использование в хирургической практике. Дисс. докт. мед. Наук. М., 1971, 355 с.; К.С. Симонян, К.П. Гутионтова, Е.Г. Цуринова. Посмертная кровь в аспекте трансфузиологии. М., Медицина, 1975, 271 с.]. В настоящее время используются компоненты посмертной крови: фибринолитически активная плазма, эритроцитная масса, лейкоцитная масса, тромбоцитная масса [Г.Я. Левин. Гемокоагуляционные свойства и клиническое применение плазмы и тромбоцитов кадаверной крови. Автореф. докт. дисс. М., 1978, 31 с; В.Б. Хватов. Препараты фибринолитического и антипротеназного действия из плазмы крови внезапно умерших людей. Дисс. докт. мед наук, 1984, 417 с.; V.B. Khvatov Plasmakinase - a new thrombolytic preparation from postmortem plasma In: Thrombosis and Thrombolysis edd. E.I. Chazov, V.V. Smirnov). Consultants Bureau, N.Y., L, 1986, p. 283-310; В.Б. Хватов. Медико-биологические аспекты использования посмертной крови. Вестник АМН СССР, 1991, 9. С. 18-24; В.Б. Хватов. Трупная кровь - история и современное состояние вопроса. Пробл. гематол. и перелив. крови, 1997, 1. С. 51-59]. Компоненты трупной крови, получаемые от доноров органов, также получили клиническое применение [погибший индивидуум с бьющимся сердцем согласно “Инструкции по констатации смерти человека на основании диагноза смерти мозга» от 20.12.2001 г. №460, регистрация Минюста №3170 от 17 января 2002]. Трансплантация органов, тканей и клеток осуществляется согласно Закону РФ «О трансплантации органов и (или) тканей человека» - в ред. Федеральных законов от 20.06.2000 №91-Ф3, от 16.10.2006 №160-Ф3; В.Б. Хватов, С.В. Журавель, В.А. Гуляев, Е.Н. Кобзева, М.С. Макаров. Биологическая полноценность и функциональная активность клеточных компонентов крови доноров органов. Трансплантология, 2011, 4, с. 13-19; Хубутия М.Ш., Хватов В.Б., Гуляев В.А. и др. Способ компенсации глобулярного объема крови и иммуномодулирующего воздействия при трансплантации. Патент РФ на изобретение №2452519, опубл. 10.06.2012, бюл. №16].

Фибринолитически активную плазму получают из крови внезапно умерших людей, заготовленной на консерванте Глюгицир (соотношение кровь: консервант 4:1) для сохранения ее фибринолитически активных свойств. Отделение плазмы от клеточных элементов крови производят в стерильном боксе с соблюдением всех правил асептики и антисептики и аналогично получению донорской плазмы из консервированной донорской крови. Клиническое использование ФАП в хирургии и травматологии выявило эффект стимуляции заживления ран [И.Ю. Клюквин, М.В. Звездина, В.Б. Хватов, Ф.А. Бурдыга. Способ лечения укушенных ран. Патент на изобретение РФ №2372927, опубл., 20.11.2009, бюлл. №32]. Этот эффект мы связывали с присутствием ростстимулирующих факторов в ФАП, выделяемых активированными тромбоцитами. В дальнейшем в ФАП нами идентифицирован тромбоцитарный фактор роста (PDGF). Ростстимулирующее действие ФАП в культуре клеток человека показано в специальных исследованиях. В клеточную суспензию фибробластов человека линии М-20, содержащую известное количество клеток, добавляли исследуемые образцы ФАП в 10% концентрации и по 10 мл полученной смеси помещали в культуральные флаконы с площадью ростовой поверхности 25 см 2 . Клетки выращивали в течение 3-4 суток при содержании в атмосфере 5% CO 2 и при 37°C. После 3-кратного пассирования проводили подсчет выросших клеток в камере Фукс-Розенталя и определяли отношение числа выросших клеток к числу посаженных - индекс пролиферации (в таблице 1).

Из проведенных опытов следует, что ростовые свойства ФАП обеспечивают высокую пролиферативную активность и не отличаются от таковой эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. При этом ФАП содержит ростовые факторы тромбоцитов человека, т.е. аллогенного типа, в отличие от эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота - ксеногенного типа. Этот факт является определяющим при трансплантации клеток при заместительной терапии. Отметим, что ростстимулирующее действие на культуру клеток линии М-20 обусловлено, в частности, наличием в ФАП PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл. Эти данные получены с помощью набора реагентов «Qantikine, Human PDGF-BB Immunoassay» фирмы «R & D Systems» и системы «Multiskan ascent» фирмы «Thermo». Концентрация PDGF-BB в ФАП сходна с его содержанием в сыворотке крови. Так в сыворотке доноров крови и обследованных пациентов содержание PDGF составило от 110 до 880 пг/л, в среднем 244 пг/мл, тогда как в плазме содержание PDGF варьировало от 0-2 пг/мл.

Для лучшего понимания предлагаемого технического решения «производство диплоидных клеток человека линии М-20 для медико-биологических целей» приводим следующий пример.

Клетки линии М-20 16 пассажа восстанавливают из рабочего банка. Для этого криопробирку с клетками извлекают из жидкого азота и помещают в водяную баню при температуре 38°C и после оттаивания содержимое переносят в культуральный сосуд с питательной средой ДМЕМ, содержащей 10% ФАП (с содержанием PDGF от 155 до 342 пг/мл), добавляют антибиотик гентамицин из расчета 1 мл 4% раствора на 1 л питательной среды. Для формирования монослоя клетки культивируют в течение 4-5 суток при 37°C и содержании CO 2 в атмосфере 5%. После формирования монослоя клеток проводят 3 последовательных пассажа, необходимых для репарации ДНК после криоконсервирования. Затем проводят тиражирование клеток с 20 по 33 пассаж. Клетки этих пассажей предназначены для медико-биологических целей. Полученная линия клеток подробно охарактеризована в соответствии с требованиями ВОЗ и ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича, включая HLA-типирование клеток линии М-20, а также проведено изучение ее цитокинового спектра. Приводим сравнительную характеристику свойств линии М-20 и линии М-22 (таблица 2). Линия М 22 (диплоидные фибробласты человека) лицензирована в качестве вакцинного субстрата и разрешена для производства любых видов медицинских вирусных вакцин, а также применена для лечения ожоговых ран II-IIIA степени [Патент РФ на изобретение №2373944, 23.06.2008. Способ лечения ожоговой раны. А.С. Ермолов, С.В. Смирнов, В.Б. Хватов, Л.Л. Миронова, О.И. Клнюшко, Е.А. Жиркова, B.C. Бочарова].

Линия М-20 установлена в ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН в 1986 году из кожи и мышц 10-недельного эмбриона человека, полученного в результате аборта от здоровой женщины. Онкологических, венерических заболеваний, гепатита, туберкулеза в анамнезе не обнаружено; генетических и врожденных заболеваний в семье не наблюдалось. Среда культивирования клеток ДМЕМ с добавлением 10% ФАП. Коэффициент рассева 1:3-1:4 дважды в неделю при посевной дозе клеток 7×10 4 кл/мл. Клеточный монослой состоит из ориентированных однородных веретеновидных клеток с овальными ядрами, содержащими 1-3 ядрышка и мелкие глыбки хроматина. В жизненном цикле линии можно выделить 3 фазы развития: становление 1-3 пассажи, активный рост 4-40 и старение 41-52, затем наступала гибель. Клетки линии имеют кариотип человека 2т=46, ХУ. Линия характеризуется высокой генетической стабильностью: 93,3-96,9% клеток имеют диплоидный набор хромосом, клеток с полиплоидным набором не более 1,6%. Пробелов и разрывов, а также кольцевых хромосом не наблюдали. Количество полос изоэнзимов Г-6ФДЕ и ЛДЕ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа. При посеве на селективные питательные среды контаминации бактериями, грибами, микоплазмами не обнаружено. Кроме этого контаминации микоплазмами не выявлено при окраске ДНК-флуорохромами Hochst 33258 и оливомицином, а также методом ПЦР. Контаминации вирусами в опытах на сосунках и взрослых белых мышах, морских свинках, кроликах и куриных эмбрионах, а также на гомологичных и гетерологичных культурах клеток не обнаружено. Контроль туморогенности. При введении клеток линии иммунодепрессированным животным опухоли не образовывались. Обратной транскриптазы не обнаружено. HLA-маркеры: Класс I: A*(02.03)/B*(07.40)/CW*(03.07). Класс II: DRB1*(15.16)/DQB1*(05.06). Клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК α-интерферона (ИФНα) и интерлейкинов: ИЛ1β, 2, 4, 6, 8, 10, 18.

Таким образом, предлагаемая линия является диплоидной - обладает ограниченным сроком жизни, сохраняет кариотип нормальных клеток человека на протяжении всей жизни, свободна от контаминантов и не обладает онкогенными потенциями. Она охарактеризована на безопасность в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича. В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН имеются банки посевных и рабочих клеток, способные обеспечить все потребности производства и научных исследований. Клетки линии М-20 чувствительны к заражению различными вирусами. Дополнительно изучен цитокиновый спектр линии М-20. Знание цитокинового спектра клеток позволяет более точно оценивать результаты при определении интерферонового статуса больных и давать обоснованные рекомендации по применению лечебно-профилактических препаратов.

Диплоидные клетки человека - фибробласты штамма М-20 с повышенной пролиферативной активностью, получаемые предлагаемым способом, могут быть использованы для диагностических целей, в частности для определения активности интерферона (ИФН) в сыворотке крови человека, а также в лечебных целях, например для местного лечения пролежней, укушенных ран, длительно не заживающих и ожоговых ран.

1. Способ повышения пролиферативных свойств диплоидных клеток фибробластов человека, отличающийся тем, что диплоидные клетки охарактеризованной линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН масштабируют из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа и получают банк рабочих клеток 16 пассажа, при этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных и/или диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пг/мл.

2. Способ по п.1, в котором при культивировании клеток используют питательную среду ДМЕМ с 10% ФАП.

Похожие патенты:

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению клеток плацентарного перфузата человека в получении лекарственного средства для подавления пролиферации опухолевых клеток у индивида.

Группа изобретений относится к области биотехнологии и онкологии. Способ предусматривает: а) выделение постнатальных тканеспецифичных мультипотентных аутологичных стволовых клеток (АСК) и/или аутологичных прогениторных клеток (АПК) для их последующего протеомного и полнотранскриптомного анализов; б) выделение АСК и/или АПК и/или мультипотентных аллогенных HLA-гаплоидентичных стволовых клеток (HLA-CK) для последующего ремоделирования их протеомного профиля; в) выделение РСК из опухоли пациента; г) протеомный анализ АСК и/или АПК и РСК; д) полнотранскриптомный анализ АСК и/или АПК и РСК; е) определение набора белков, каждый из которых содержится в протеомных профилях как АСК и/или АПК, так и РСК; ж) анализ ранее определенного набора белков для идентификации в РСК внутриклеточных сигнальных путей, не подвергшихся неопластической трансформации в результате канцерогенеза, и определения белков-мишеней, являющихся мембранными акцепторами идентифицированных сигнальных путей; з) анализ полнотранскриптомного профиля экспрессии генов РСК и подтверждение сохранности и функциональной значимости структурных компонентов идентифицированных сигнальных путей в РСК; и) определение белков-лигандов, способных активировать белки-мишени; к) сравнительный анализ полнотранскриптомных профилей АСК и/или АПК с транскриптомными профилями, содержащимися в известных базах данных транскриптомов, для определения пертурбогенов, способных модифицировать профиль экспрессии генов АСК и/или АПК и/или HLA-CK, выделенных для ремоделирования их протеомного профиля, в направлении секреции ранее определенных белков-лигандов; л) ремоделирование протеомного профиля АСК и/или АПК и/или HLA-CK пертурбогенами с получением модифицированного транскриптомного профиля различных клеточных систем, способных оказывать регуляторное воздействие на РСК пациента.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Популяцию мононуклеарных клеток или неэмбриональных стволовых клеток, обогащенную клетками моноцитарной линии дифференцировки, содержащей промоноциты, применяют для лечения ишемии у субъекта.

Изобретение относится к области биотехнологии и клеточной технологии. Заявленное изобретение направлено на создание плюрипотентных, мультипотентных и/или самообновляющихся клеток, которые способны начать дифференцироваться в культуре в различные типы клеток и способны к дальнейшей дифференцировке in vivo.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для отбора сперматозоидов в методах вспомогательных репродуктивных технологий. Способ предусматривает размещение в чашке Петри капли спермы и капли культуральной среды на расстоянии друг от друга не более 5 см, соединение капель полосой из вязкой среды с параметрами вязкости 1-4 Па·с, затем инкубируют чашку с содержимым в течение 30-90 мин в условиях, моделирующих естественную среду цервикального канала женского репродуктивного тракта.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и клеточных технологий. Способ дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, представляющих собой линию клеток человека, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, включает обработку плюрипотентных стволовых клеток средой, отличающейся тем, что она не содержит активин А и содержит GDF-8, в течение периода времени, достаточного для того, чтобы плюрипотентные стволовые клетки дифференцировались в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы.

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены варианты олигопептида, выделенные из белка RAB6KIFL (KIFL20A), которые способны индуцировать цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) в составе комплекса с молекулой HLA-A*0201.

Изобретение относится к области пищевой промышленности и представляет собой способ пивоварения, включающий добавление к суслу термостабильной протеазы после фильтрации сусла, но перед варкой сусла, причем термостабильность протеазы означает, что активность этой протеазы составляет по меньшей мере 70% ее активности, измеренной согласно следующему методу: протеазу разводят до концентрации 1 мг/мл в аналитическом буфере, содержащем 100 ммоль сукциновой кислоты, 100 ммоль HEPES, 100 ммоль CHES, 100 ммоль CABS, 1 ммоль СаСl2, 150 ммоль КСl, 0,01% Тритон Х-100, и с рН, доведенным до 5,5 с помощью NaOH; после чего протеазу преинкубируют i) во льду и ii) 10 мин при 70°С; субстрат, к которому протеаза проявляет активность, суспендируют в 0,01% Тритоне Х-100: для начала реакции в пробирку добавляют 20 мкл протеазы и инкубируют в термомиксере Эппендорфа при 70°С, 1400 об/мин в течение 15 минут; реакцию останавливают помещением пробирок в лед; образцы центрифугируют холодными при 14000 g в течение 3 минут и измеряют оптическую плотность OD590 супернатанта; полученное значение OD590 образцов без протеазы вычитают из полученного значения OD590 образцов, обработанных протеазой; определяют термостабильность протеазы посредством расчета процентной активности протеазы в образцах, преинкубированных при 70°С, относительно активности протеазы в образцах, инкубированных во льду, как 100%-ной активности.

Изобретение относится к области клеточной биологии, клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. Способ повышения ангиогенной активности стромальных клеток жировой ткани в тканях и органах включает выделение стромальных клеток жировой ткани, культивирование выделенных клеток в присутствии фактора некроза опухолей-альфа в количествах 5 или 100 нг/мл в течение 24-72 часов с последующим трансплантированием в ткани или органы.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточным технологиям и тканевой хирургии. Способ получения культуры гладкомышечных клеток заключается в том, что вырезают фрагмент кровеносного сосуда, измельчают его на кусочки до размеров не более 2 мм в любом измерении и инкубируют кусочки в культуральном флаконе с предварительно нанесенными на дно флакона царапинами, содержащем среду для культивирования, содержащую 10% эмбриональной фетальной сыворотки, в течение по меньшей мере 10 дней, но не более 24 дней, при температуре 37°С в условиях СО2-инкубатора, отличающийся тем, что упомянутым фрагментом кровеносного сосуда является фрагмент восходящего отдела грудной аорты, вырезаемый в ходе процедуры аортокоронарного шунтирования, а упомянутые кусочки фрагмента восходящего отдела грудной аорты перед инкубированием выдерживают в среде для культивирования, содержащей 0,1% коллагеназы, в течение по меньшей мере 30 минут, но не более 60 минут, при температуре 37°С, после чего промывают средой для культивирования клеток.

Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека и мезенхимальные стволовые клетки, полученные этим способом // 2528250

Изобретение относится к области генетической инженерии, тканевых технологий и медицины. Способ получения мезенхимальных стволовых клеток из плюрипотентных линий стволовых клеток человека включает получение эмбриоидных телец из плюрипотентных стволовых клеток человека, прикрепление эмбриоидных телец к чашке Петри для индукции спонтанной дифференцировки эмбриоидных телец в мезенхимальные стволовые клетки, культивирование с пролиферацией мезенхимальных стволовых клеток при сохранении идентичности мезенхимальных стволовых клеток, и где индукция спонтанной дифференцировки стадии происходит путем формирования петель аутологичного цитокина без добавления внешнего цитокина, также соответствующие клетки, их применение, набор и способ культивирования.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биохимии и медицины. Предложена композиция для индукции миграции стволовых клеток жировой ткани взрослых, которая содержит в качестве активного ингредиента человеческие мезенхимальные стволовые клетки из жировой ткани взрослых в количестве от 1х107 до 1х1010, которые экспрессируют на клеточной поверхности рецептор хемокина или фактора роста, или секреторный продукт из этих стволовых клеток включает рецептор хемокина или фактора роста; где секретируемый продукт стволовых клеток жировой ткани взрослых представляет собой адипонектин; и где человеческие стволовые клетки жировой ткани взрослых подвергаются первичному воздействию смесью, содержащей хемокин или фактор роста.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложен способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипатентных мезенхимальных клеток (ММСК), включающий культивирование ММСК из стромально-васкулярной фракции жировой ткани до достижения монослоя при концентрации O2 в среде 5%, добавление суспензии пкМНК к монослою ММСК, культивирование в течение 72 часов при концентрации O2 в среде 5%, отбор неприкрепленных пкМНК и замену среды, продолжение культивирования ММСК с прикрепившимися к ним пкМНК в течение 7 дней при концентрации O2 в среде 5%.

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложена композиция, содержащая стволовые клетки из амниотической жидкости человека с фенотипом CD73+/CD90+/CD105+/CK19+, питательную среду, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и коллаген, взятые в эффективном количестве.

Изобретение относится к области медицины и клеточных технологий. Предложен клеточный продукт, содержащий популяцию протоковых стволовых клеток подчелюстной слюнной железы, характеризующихся фенотипом CD49f+/EpCAM+ и после обработки вальпроевой кислотой в концентрации 0,1-40 мМ и культивирования в коллагеновом геле меняющих профиль экспрессии на 1AAT+/PEPCK+/G6P+/TDO+/CYP Р4503А13+, а также приобретающих способность синтезировать мочевину и альбумин.

Изобретение относится к области биотехнологии, клеточной и тканевой инженерии. Описан способ получения резидентных стволовых клеток сердца млекопитающего, экспрессирующих поверхностные маркеры c-kit, и/или sca-1, и/или MDR1, в ходе которого выделяют образцы ткани миокарда, измельчают их, обрабатывают коллагеназой и трипсином, проводят культивирование на культуральной чашке с покрытием из фибронектина методом эксплантной культуры измельченных образцов с последующей иммуноселекцией.

Изобретение относится к области биохимии, биотехнологии и медицины. Предложен N-концевой фрагмент растворимого супрессора иммунного ответа длиной в 21 аминокислоту, имеющий последовательность аминокислот по Seq ID NО: 1, позволяющий стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов, а также способ стимуляции образования регуляторных Т-лимфоцитов N-концевым фрагментом растворимого супрессора иммунного ответа с Seq ID NО: 1, при введении его в концентрации 0,1-50 мкг/мл.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и представляет собой дерматологический крем, предназначенный для местного лечения бактериальных инфекций кожи и для заживления связанных с ними ран, содержащий фрамицетина сульфат и биополимер, включенные в кремовую основу, которая содержит по крайней мере одно вещество из каждой следующей группы: консервант; первичный и вторичный эмульгатор, выбранные из группы, содержащей кетостеариловый спирт, кетомакрогол 1000, полисорбат-80 и Span-80; парафин в качестве воскообразного продукта; совместный растворитель, выбранный из группы, включающей пропиленгликоль, гексиленгликоль и полиэтиленгликоль-400; азотную кислоту или молочную кислоту и воду, а указанный биополимер предпочтительно является хитозаном.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Способ включает масштабирование диплоидных клеток линии М-20 из криобанка ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН из ампулы банка посевных клеток 7 пассажа с получением банка рабочих клеток 16 пассажа. При этом клетки 20-33 пассажей, пригодные для использования в лечебных иили диагностических целях, получают путем культивирования в питательной среде, содержащей 10 фибринолитически активной плазмы человека, содержащей тромбоцитарный фактор роста PDGF в концентрации от 155 до 342 пгмл. Изобретение позволяет повысить пролиферативную активность диплоидных клеток фибробластов человека. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Основное направление деятельности современной эстетической медицины - предотвращение старения при помощи высоких технологий. В результате научных исследований выявлена закономерность, заключающаяся в том, что клетки имеют способность возрождаться. Обладают этими свойствами и фибробласты, регенерация которых приводит к омоложению кожных покровов и устранению видимых дефектов на них.

Функции и природа фибробластов

Термин «фибробласты» состоит из двух латинских слов, переводимых буквально как «росток» и «волокно». По своей природе они представляют клетки соединительной ткани, синтезирующие внеклеточный матрикс (структуру ткани, которая обеспечивает перенесение химических веществ и механическую поддержку клеток кожи). Фибробласты вырабатывают вещества, которые являются предшественникам коллагеновых и эластиновых волокон, гиалуроновую кислоту, фибрин.

Происходят они из мезенхимы - зародышевой ткани, которая есть в клетках организма людей и животных. В активном состоянии структура фибропластов подразумевает наличие ядра и отростков, они имеют увеличенный размер и содержат большое количество рибосом, в состоянии покоя они уменьшаются и приобретают веретенообразную форму.

Фибробласты кожи обладают широким спектром функций. Благодаря их наличию в организме происходят следующие процессы:

• Активизация процессов синтеза коллагена и эластина.
• Формирование сосудов.
• Направление клеток иммунной системы к бактериям и чужеродным частицам.
• Ускорение разрастания тканей.
• Усиление роста клеток.
• Заживление поврежденных участков кожи.
• Выработка ряда белков (протеогликан, ламинин и другие).

Причины возрастных изменений

Молодость кожи определяется цикличным процессом выработки коллагена и эластина, которые впоследствии расщепляются на составные части, используемые фиброластами для их повторной выработки. Со временем последние снижают свою активность, переставая производить коллагеновые и эластиновые волокна, что в конечном итоге провоцирует старение кожи.

Возрастные изменения начинают проявляться уже с 28 — 30 лет. Они выражаются в потере упругости и развитии птоза, изменении цвета кожи, повышении сухости, образовании морщин. И все это в связи с тем, что каждое десятилетие фибробласты уменьшаются на 10 % от первоначального числа.

Восполнение количества фибробластов

Итак, для того чтобы замедлить старение и вернуть молодость необходимо восстановить фибробласты . Большинство современных косметологических методик приводит лишь к временному ускорению синтеза коллагеновых волокон, но не увеличивают сами клетки. Долгое время было принято считать, что это попросту невозможно.

В настоящее время наука шагнула далеко вперед, и восстановление фибробластов это уже не фантастика. Данная процедура получила название SPRS-терапия и широко практикуется в Штатах, европейских странах и с недавнего времени на территории России.

SPRS-терапия: особенности и принцип проведения

Восстановить фибробласты непросто, для этого требуется пройти через сложнейшую инъекционную процедуру. Результатами ее проведения являются утолщение кожи и повышение уровня ее эластичности, профилактика и снижение птоза. Также уменьшаются морщины, исчезает пигментация и разглаживаются рубцы.

Начинается терапия с забора клеток пациента с кожи, расположенной за ушной раковиной. Полученный образец используется для диагностики и изучения, именуется биоматериалом. Он применяется для разработки схемы лечения и искусственного воссоздания фибробластов, которые впоследствии при помощи уколов будут введены обратно в кожу.

Клетки, выращенные на основе биоматериалов пациента, не отторгаются организмом. После трансплантации они сохраняют свою активность в течение полутора лет, на протяжении которых состояние кожи улучшается.

Фибробласты не рекомендуется внедрять посредством инъекций во время обострения хронических заболеваний, при простуде, вирусных инфекциях, сопровождающихся повышенной температурой тела. Среди противопоказаний числится иммунодефицит, злокачественные образования, инфекции и хронические заболевания в острой стадии. Перед проведением процедуры обязательна предварительная консультация со специалистом для выявления индивидуальных противопоказаний.

Процедура занимает не более часа и проводится курсом из 2 сеансов с перерывом от 5 до 7 недель. Перед инъекциями обязательно проведение местной анестезии.

Внедрить фибробласты - удовольствие дорогостоящее. Полный спектр услуг, включающий забор, хранение, исследование и введение биоматериалов оценивается примерно в 400 000 рублей.

Видео: проведение SPRS терапии

Фибробласты - клетки соединительной ткани, обеспечивающие выработку коллагена и эластина, следовательно, поддерживающие молодость нашей кожи. Со временем их количество в организме неуклонно снижается, за счет чего и проявляются внешние признаки возрастных изменений. Восстановление числа фибробластов проводится посредством инъекционной методики на основе искусственно выращенных клеток.

1. Продукция всех компонентов межклеточного вещества (волокон и основного аморфного вещества). Фибробласты синтезируют коллаген, эластин, фибронектин, гликозаминогликаны и др.

2. Поддержание структурной организации и химического гомеостаза межклеточного вещества (за счет сбалансированных процессов его выработки и разрушения).

3. Регуляция деятельности других клеток соединительных тканей и влияние на другие ткани. Продукция цитокинов (колониестимулирующих факторов гранулоцитов и макрофагов).

4. Заживление ран. При воспалении и заживлении ран фибробласты активируются макрофагами.

Рис. 3.2. Рыхлая и волокнистая соединительные ткани – пленочный препарат I – основное вещество; II – коллагеновые волокна; III – эластические волокна; IV – клетки; V – кровеносный сосуд. 1 – фибробласты, 2 – фиброцит, 3 – макрофаги, 4 – тучные клетки, 5 – плазмоциты, 6 – лейкоциты, 7 – жировая клетка.

Рис.3.3. Электронограмма фибробласта среди коллагеновых волокон
(х 18.500).

Ct- поперечные,

Сl – продольные срезы коллагеновых волокон;

N – ядро клетки смещено на периферию;

ER – эндоплазматический ретикулум;

G – комплекс Гольджи.

Рис. 3.4. Актиновые микрофиламенты в цитоплазме миофибробласта (иммунофлюоресцентный метод).

Макрофаги. На втором месте в количественном отношении среди клеток рыхлой соединительной ткани стоят макрофаги Макрофаги образуются путем дифференцировки и размножения, вышедших в ткань из крови моноцитов. Различают свободные и фиксированные макрофаги.По сравнению с фибробластами они меньших размеров 10-15 мкм. Имеют различную форму - округлую, вытянутую или неправильную. В базофильной цитоплазме макрофагов содержится много лизосом, фагосом, пиноцитозных пузырьков. Умеренное развитие имеют митохондрии, ЭПС, комплекс Гольджи. Макрофаги – активно фагоцитирующие клетки, богатые органеллами для внутриклеточного переваривания поглощенного материала (лизосомы) и синтеза антибактериальных и других биологически активных веществ (пироген, антиферон, лизоцим, ЭПС). Ядра содержат больше хроматина и окрашиваются более интенсивно, чем ядра фибробластов. Цитоплазма макрофагов образует глубокие складки и длинные микроворсинки, которые обеспечивают захват инородных частиц. Поверхность макрофага имеет рецепторы чувствительные к эритроцитам, T и B-лимфоцитам, антигенам и иммуноглобулинам. Последние обеспечивают возможность их участия в иммунных реакциях организма.

А

Б

Рис. 3.5. Ультраструктура макрофага. А – активная форма, Б –поверхность макрофага (х11.600). Сканирующая электронная микроскопия. 1– отростки клетки. Pp, 1 –псевдоподии; Р –фагоцитированные частицы; М – митохондрии; L – лизосомы. Ядро неправильной формы.

Макрофаги наряду со способностью к фагоцитозу синтезируют целый ряд веществ, обеспечивающих врожденный иммунитет (лизоцим, интерферон, пироген и др.). Макрофаги секретируют медиаторы - монокины, способствующие специфической реакции на антигены и цитолитические факторы, которые избирательно разрушают опухолевые клетки.

Функции макрофагов:

1. фагоцитоз: распознавание, поглощение и переваривание поврежденных, зараженных, опухолевых и погибших клеток, компонентов межклеточного вещества, а также экзогенных материалов и микроорганизмов.

2. участие в индукции иммунных реакций, т.к. (играют роль антиген-представляющих клеток).

3. регуляция деятельности клеток, других типов (фибробластов, лимфоцитов, тучных клеток, эндотелиоцитов и др.).

Макрофаги развиваются из моноцитов. Совокупность клеток, имеющих одно ядро, называется монокулиарной фагоцитарной системой, и мононукледов, обладающих способностью к фагоцитозу: захватывать из тканевой жидкости организма инородные частицы, погибающие клетки, неклеточные структуры, бактерии и др. Фагоцитированный материал подвергается внутри клетки ферментативному расщеплению (“завершенный фагоцитоз”), благодаря чему ликвидируются вредные для организма агенты, возникающие местно или проникающие извне. Макрофаги (гистиоциты) рыхлой волокнистой соединительной ткани, звездчатые клетки синусоидных сосудов печени, свободные и фиксированные макрофаги кроветворных органов (костного мозга, селезенки, лимфатических узлов), макрофаги легкого, воспалительных экссудатов (перитонеальные макрофаги), остеокласты, гигантские клетки инородных тел и глиальные макрофаги нервной ткани (микроглия). Все они способны к активному фагоцитозу, имеют на своей поверхности рецепторы к иммуноглобулинам и происходят из промоноцитов костного мозга и моноцитов крови. В отличие от таких “профессиональных” фагоцитов способность к факультативному поглощению может быть выражена независимо от указанных циторецепторов у других клеток (фибробласты, ретикулярные клетки, эндотелиоциты, нейтрофильные лейкоциты). Но эти клетки не входят в состав макрофагической системы.

И.И. Мечников (1845-1916) первым пришел к мысли о том, что фагоцитоз, возникающий в эволюции как форма внутриклеточного пищеварения и закрепившийся за многими клетками, одновременно является важным защитным механизмом. Он обосновал целесообразность объединения их в одну систему и предложил назвать ее макрофагической. Макрофагическая система представляет собой мощный защитный аппарат, принимающий участие, как в общих, так и в местных защитных реакциях организма. В целостном организме макрофагическая система регулируется как местными механизмами, так нервной и эндокринной системами. В 30-40-х годах эту защитную систему называли ретикулоэндотелиальной. В последнее время ее называют системой мононуклеарных фагоцитов, что, однако, неточно характеризует ее в связи с тем, что среди клеток, входящих в эту систему, есть и многоядерные (остеокласты).

Плазматические клетки – плазмоциты имеют округлую форму. Величина плазматических клеток от 7 до 10мкм. Ядро округлой или овальной формы лежит, как правило, эксцентрично. Глыбки хроматина в нем расположены по радиусам. Они напоминают пирамиды, основание которых лежит на ядерной оболочке. Создается впечатление, что хроматин расположен в виде спиц в колесе. Данное обстоятельство служит одним из диагностических признаков при определении плазмоцитов.

А

Б

В

Рис. 3.6. Плазматическая клетка. А – в мазке крови. Б – схема. В – электронограмма.

Цитоплазма клеток резко базофильна, особенно по периферии. В центре перед ядром имеется небольшое просветление - "дворик". Он содержит сетчатый аппарат, центриоли, митохондрии. Цитохимически в плазматических клетках обнаруживается громадное количество рибонуклиопротеидов, обусловливающих базофилию цитоплазмы. Среди белков обнаруживается много – γ-глобулина. С ним связывается основная функция клеток - участие в защитных реакциях организма.

Зрелые плазматические клетки характеризуются высокой базофилией и эксцентрично расположенным ядром. Под электронным микроскопом определяются параллельные мембраны. Наличие параллельных мембран в цитоплазматической сети характерно для клеток, синтезирующих белок на “экспорт”. Вырабатываемый плазматической клеткой белок может иметь различный состав и определяется качеством белка раздражителя или антигена. Поэтому мы говорим, что синтез белка в плазматических клетках - частное выражение способности этих клеток принимать участие в белковом обмене. Наряду с этим цитоплазма клетки выделяет небольшое количество гликозаминогликанов, поступающих в межклеточное вещество.

Сравнение концентрации глобулина показало, что в зрелых клетках его меньше, чем в незрелых. В последнее время считают, что зрелая клетка - это плазматическая клетка в состоянии покоя. При встрече с антигеном, раздражителем она также может интенсивно образовывать глобулин и по своим морфологическим признакам приближаться к той клетке, которую называют "незрелой". Плазматические клетки называют иммунокомпетентными, т. к. они сохраняют "память" об антигенных раздражителях и при повторной встрече с ним блокируют антиген специфическим антителом.

Одно из проявлений иммунной реакции у позвоночных животных при попадании в организм чужеродного агента - выделение плазматическими клетками антител.

В цитоплазме плазматических клеток могут появляться кристаллические включения, воспринимающие кислые красители, так называемые тельца Русселя. Считают, что они являются конгломератами глобулинов, синтезированных ранее этой клеткой.

Плазматические клетки обеспечивают гуморальный иммунитет путем выработки антител. За 1 секунду каждый плазмоцит синтезирует до нескольких тысяч молекул иммуноглобулииов (более 10 млн. молекул в час).

Тканевые базофилы (лаброциты, тучные клетки). Тучные клетки – постоянный клеточный компонент рыхлой волокнистой соединительной ткани, осуществляющий важные регуляторные функции. Эти клетки имеют в цитоплазме зернистость, напоминающую гранулы базофильных лейкоцитов. Они являются регуляторами местного гомеостаза соединительной ткани.

А

Б

Рис. 3.7. Структура тучной клетки А – Тучные клетки (М) в составе соединительной ткани (х1200); Б – рельеф клеточной поверхности.

Развитие тучных клеток осуществляется в тканях из предшественника, который имеет, как предполагают, костномозговое происхождение. На их дифференцировку и рост влияют факторы клеточного микроокружения (фибробласты, эпителиальные клетки и их продукты). В отличие от базофилов, которые после миграции в ткани живут недолго (от нескольких часов до нескольких суток), тучные клетки обладают сравнительно большой продолжительностью жизни (от нескольких недель до нескольких месяцев). В течение этого периода под действием соответствующих стимулов тучные клетки, очевидно, способны делиться.

Рис. 3.8. Электронограмма тучной клетки (х12.000). G – крупные гранулы заполняют всю цитоплазму; Мi – митрхондрии расположенные между ними, в центре расположено ядро.

Тканевые базофилы имеют разнообразную форму. У человека и млекопитающих чаще их форма овальная. Размеры 3,5х14 мкм. Ядро небольшое, богатое хроматином. Встречаются двуядерные клетки.

Гранулы тучных клеток содержат разнообразные биологически активные вещества. Субмикроскопически они представляют плотные тельца неправильной формы диаметром 0,3-1,4 мкм, окрашиваются метахроматично. Клетки содержат митохондрии, внутриклеточный сетчатый аппарат. Компоненты тучных клеток у различных животных и в различных участках соединительной ткани различные. У кроликов и морских свинок тучных клеток мало, у белых мышей очень много. У человека и животных тучные клетки обнаружены во всех местах, где имеются прослойки рыхлой соединительной ткани. Они расположены группами по ходу кровеносных и лимфатических сосудов. Количество тучных клеток изменяется при различных состояниях организма - при беременности увеличивается количество тучных клеток в матке и молочных железах, в желудке и кишечнике в разгар пищеварения. Тучные клетки содержат разнообразные медиаторы и ферменты.

Структурно-функциональные различия тучных клеток. Популяция тучных клеток образована элементами, которые обладают неодинаковыми морфофункциональными свойствами и могут качественно и количественно различаться даже в пределах одного органа. Высказывают предположение о том, что отдельные субпопопуляции тучных клеток выполняют в организме неодинаковые функции.

Функции тучных клеток:

1. Гомеостатическая , которая осуществляется в физиологических условиях путем медленного выделения небольших количеств биологически активных веществ, способных влиять на различные тканевые функции – в первую очередь, на проницаемость и тонус сосудов, поддержание баланса жидкостей в тканях.

2. Защитная и регуляторная, которая обеспечивается путем локального выделения медиаторов воспаления и хемотаксических факторов, обеспечивающих (а) мобилизацию эозинофилов и различных эффекторных клеток, участвующих в так называемых реакциях поздней фазы; (б) воздействие на рост и созревание соединительной ткани в зоне воспаления.

3. Участие в развитии аллергических реакций вследствие наличия высокоаффинных рецепторов к иммуноглобулинам класса Е (IgE) на их плазмолемме и функциональной связи этих рецепторов с секреторным механизмом. Участие тучных клеток в развитии аллергических реакций, как и базофильных гранулоцитов включает:

Ø связывание IgE с высокоаффинными рецепторами на их плазмолемме;

Ø взаимодействие мембранного IgE с аллергеном;

Ø активацию и дегрануляцию тучных клеток с выделением содержащихсяв их гранулах веществ и продукцией ряда новых.

Ø предполагается, что тучные клетки выполняют магниторецепторную функцию.

Дегрануляция может опосредоваться также рецепторами комплемента или вызываться белками нейтрофилов, протеиназами, нейропептидами (вещество Р, соматостатин), лимфокинами.

По подсчетам Уокера полная смена тучных клеток рыхлой соединительной ткани может произойти за 16 – 18 месяцев. По данным Н.Г.Хрущева за 9 дней.

Таблица 3.2.

Медиаторы и ферменты, содержащиеся в тучных клеток

Медиатор	Функция
Гистамин	Н 1 , Н 2 – рецептор опосредованное действие на гладкомышечные клетки (ГМК), эндотелий, нервные волокна. Вазодилатация, повышение проницаемости капилляров, отек, хемокинез, бронхоспазм, стимуляция афферентных нервов
Химаза	Расщепление коллагена IV типа, глюкагона, нейротензина, фибронектина
Триптаза	Конверсия С3 в С3а, расщепление фибриногена, фибронектина, активация коллагеназы
Карбоксипептидаза В	Разборка внеклеточного матрикса
Дипептидаза	Конверсия LTD 4 в LTE 4 . Разрушение внеклеточного матрикса
Кининогеназа	Конверсия кининогена в брадикинин
Инактиватор фактора Хагемана	Инактивация фактора Хагемана
Гексозаминидаза, глюкуронидаза, галактозидаза	Разрушение внеклеточного матрикса (гликопротеинов, протеогликанов)
β-Гликозаминидаза	Расщепление гликозаминов
Пероксидаза	Конверсия Н 2 О 2 в Н 2 О, инактивация лейкотриенов, образование липидных пероксидов
Фактор хемотаксиса эозинофилов (ECF)	Хемотаксис эозинофилов
Фактор хемотаксиса нейтрофилов (NCF)	Хемотаксис нейтрофилов
Гепарин	Антикоагулянт, избирательно связывает антитромбин III. Ингибитор альтернативного пути активации комплемента. Модифицирует активность других ранее синтезированных медиаторов.
Простагландин PGD 2 , тромбоксан TXA 2	Сокращение ГМК бронхов, вазодилатация, увеличение сосудистой проницаемости, агрегация тромбоцитов
Лейкотриены LTC 4 , LTD 4 , LTE 4 , медленно реагирующий фактор анафилаксии SRS-A	Вазо- и бронхоконстрикция, увеличение сосудистой проницаемости, отеки. Хемотаксис и /или хемокинез

Жировые клетки, липоциты. Различают две разновидности жировых клеток: клетки белого и бурого жира. Клетки белого жира моновакуалярные, имеют одну жировую вакуоль. Они располагаются в рыхлой соединительной ткани главным образом по ходу сосудов, а в некоторых участках организма (под кожей, между лопатками, в сальнике и других местах) образуя значительные скопления. Это позволяет выделить специальную жировую ткань, построенную почти исключительно из жировых клеток. Жировые клетки имеют шарообразную форму. Они больше по размеру других клеток соединительной ткани. Их диаметр 30-50 мкм. Непосредственными предшественниками жировых клеток являются малодифференцированные соединительнотканные клетки, расположенные главным образом около капилляров (перикапиллярные или адвентициальные клетки). Возможно образование липоцитов из гистиоцитов, фагоцитирующих жировые капли. В процессе дифференцировки в жировой клетке накапливаются мелкие капли нейтрального жира, которые путем слияния образуют более крупные. Основная функция липоцитов - запас жира как макроэргического соединения. При распаде его высвобождается большое количество энергии, используемой организмом как источник тепла, а также для фосфорилирования АДФ с образованием АТФ. Жир служит источником образования воды, выполняет защитную и опорную функцию. Жировые клетки синтезируют биологически активные вещества – лептин, регулирующий чувство насыщения, эстрогены и т.п.

А

Б

Рис.3.9. Клетки белого жира (апудоциты, моновакуолярные клетки) А- совокупность жировых клеток образует жировую дольку, снабженную большим количеством кровеносных сосудов (С) х480); Б – электронная микрофотография периферии 2-х апудоцитов, L – жировая вакуоль; D – мелкие капельки жира; М- митохондрии; С-коллагеновые волокна в межклеточном пространстве. (х6.000).

Рис. 3.10. Электронная микрофотография клетки бурого жира: Ядро расположено в центре,

L – жировые вакуоли,

М- митохондрии,

С – капилляры.

Жировые клетки кроме роли энергетического депо выполняют функции эндокринной железы, гормоны которой регулируют объем и массу тела. Этим гормоном является лептин .

Белая жировая ткань составляет 15-20 % массы тела взрослых самцов и на 5 % больше у самок. В некотором смысле о ней можно говорить как о крупном метаболически активном органе, поскольку она участвует главным образом в поглощении из крови, синтезе, хранении и мобилизации нейтральных липидов (жиров). (Мобилизовать жир – значит сделать его подвижным, с тем чтобы использовать как горючее” в других частях тела.) В жировой клетке при температуре тела жир находится в состоянии жидкого масла. Он состоит из триглицеридов содержащих три молекулы жирной кислоты, образующие эфир с глицерином. Триглицериды – наиболее калорийный вид питательных веществ, поэтому жир в жировых клетках представляет собой хранилище „высококалорийного” горючего, притом относительно легкого. Кроме того, у обитателей холодных стан жир участвует в регуляции температуры лежащих под ним органов. И, наконец, жир служит отличным заполнителем различных „щелей” в организме и образует „подушки”, на которых могут лежать те или иные внутренние органы.

Бурые жировые клетки обнаружены у новорожденных детей и у некоторых животных на шее, около лопаток, за грудиной, вдоль позвоночника, под кожей между мышцами. Она состоит из жировых клеток, густо оплетенных гемокапиллярами. Клетки бурого жира -поливакуолярные. Диаметр клеток бурого жира почти в 10 раз меньше, чем диаметр клеток белого жира. Эти клетки принимают участие в процессах теплопродукции. Адипоциты бурой жировой ткани имеют множество мелких жировых включений в цитоплазме. По сравнению с клетками белой жировой ткани здесь обнаруживается множество митохондрий. Бурый цвет жировым клеткам придают железосодержащие пигменты – цитохромы митохондрий. Окислительная способность бурых жировых клеток примерно в 20 раз выше белых и почти в 2 раза превышает окислительную способность мышцы сердца. При понижении температуры окружающей среды активность окислительных процессов в бурой жировой ткани повышается. При этом выделяется тепловая энергия, обогревающая кровь в кровеносных капиллярах. В регуляции теплообмена определенную роль играет симпатическая нервная система и гормоны мозгового вещества надпочечников – адреналин и норадреналин, который через циклический аденозинмонофосфат стимулирует активность тканевой липазы, расщепляющей триглицериды на глицерин и жирные кислоты. Последние, накапливаясь в клетке, разобщают процессы окислительного фосфорилирования, что приводит к высвобождению тепловой энергии, обогревающей кровь, протекающую в многочисленных капиллярах между липоцитами. При голодании бурая жировая ткань изменяется меньше, чем белая.

Пигментоциты (пигментные клетки).содержат в своей цитоплазме пигмент меланин. Они имеют отростчатую форму и подразделяются на два вида - меланоциты , которые вырабатывают пигмент, и – меланофоры , способные лишь накапливать его в цитоплазме. У людей черной и желтой рас пигментные клетки более распространены, чем определяется неизменяемый в зависимости от времени года цвет кожи. Пигментоциты имеют короткие непостоянной формы отростки. Эти клетки лишь формально относятся к соединительной ткани, так как располагаются в ней. В настоящее время имеются веские доказательства того, что эти клетки образуются из нервных гребней, а не из мезенхимы.

Таблица 3.3. Различия между белой и бурой жировыми клетками

Белая жировая клетка	Бурая жировая клетка
Широко распространена у человека: в т.ч. находится - в подкожной жировой клетчатке, - в сальнике, - в жировых отложениях вокруг внутренних органов, - в диафизах трубчатых костей (жёлтый костный мозг) и т.д.	а) Встречается у новорождённых детей - в области лопаток, - за грудиной и в некоторых других местах. б) У взрослого человека находится в воротах почек и в корнях лёгких. У животных, впадающих в спячку
В клетках ядра оттеснены к периферии.	Ядра расположены в центре клеток.
В клетках - одна большая жировая капля.	В клетках - много мелких жировых капель.
Количество митохондрий невелико.	В цитоплазме - много митохондрий (откуда - бурый цвет ткани).
Функции клетки: депонирование жира, ограничение теплопотерь, механическая защита.	Функция - обеспечение теплопродукции.
жир из белой жировой клетки расходуется, главным образом, не в ней самой, а в иных органах и тканях,	а жир бурой жировой клетки расщепляется для обеспечения теплопродукции непосредственно в ней самой.

Адвентициальные клетки . Это малоспециализированные клетки, сопровождающие кровеносные сосуды. Они имеют уплощенную или веретенообразную форму со слабобазофильной цитоплазмой, овальным ядром и слаборазвитыми органеллами. В процессе дифференцировки эти клетки, по-видимому, могут превращаться в фибробласты, миофибробласты, адипоциты. Многие авторы отрицают существование адвентициальных клеток как самостоятельного клеточного типа, считая их клетками фибробластического ряда.

Эндотелиальные клетки – выстилают сосуды, поэтому их совокупность называется сосудистым эндотелием. Строение сосудистого эндотелия сходно со строением эпителиальной ткани. Эндотелию присущи следующие общие признаки.

1. Пограничное положение покровного эпителия и эндотелия.

2. Непрерывность эндотелиальной выстилки внутри всех кровеносных и лимфоносных сосудов у позвоночных.

3. Отсутствие основного промежуточного вещества по всей окружности клеток эндотелия и эпителия.

4. Наличие базальной мембраны, выполняющей функцию опоры и фиксации эндотелиальных клеток. Её основу, как и основу базальных мембран эпителия, составляет коллаген IV типа.

5. Гетерополярность в строении клеток. У эндотелиоцитов это проявляется в образовании микроворсинок на люминальной поверхности клеток (при относительной гладкости базальной), в неравнозначности элементов цитоскелета и концентрации микропиноцитозных везикул в цитоплазме противостоящих поверхностей клеток.

6. Специализированные контакты между эндотелиальными клетками по типу замыкающих, фибриллярные полоски которых располагаются ближе к люминальной поверхности клеток, чем подчеркивается её полярность.

7. Барьерная, секреторная, транспортная функции в их идеальном сочетании.

8. Рост эндотелия в тканевых культурах в виде монослоя клеток полигональной формы, обладающих выраженным контактным торможением.

В силу этого сходства многие исследователи относят эндотелий к эпителиальной ткани. Однако эндотелий происходит из мезенхимы, на основании чего его относят к соединительной ткани.

Эндотелиальные клетки играют важную роль в процессах транскапиллярного обмена, принимают участие в образовании тканевых мукополисахаридов, гистамина, фибринолитических факторов.

Функции эндотелия:

1. Транспортная – через него осуществляется избирательный двусторонний транспорт веществ между кровью и другими тканями. Механизмы: диффузия, везикулярный транспорт (с возможным метаболическим превращением транспортируемых молекул).

2. Гемостатическая – играет ключевую роль в свертывании крови. В норме образует атромбогенную поверхность; вырабатывает прокоагулянты (тканевый фактор, ингибитор плазминогена) и антикоагулянты (активатор плазминогена, простациклин).

3. Вазомоторная – участвует в регуляции сосудистого тонуса: выделяет сосудосуживающие (эндотелин) и сосудорасширяющее (простациклин, эндотелиальный релаксирующий фактор – окись азота) вещества; участвует в обмене вазоактивных веществ – ангаотензина, норадреналина, брадикинина.

4. Рецепторная – экспрессирует на плазмолемме ряд соединений, обеспечивающих адгезию и, и последующую трансэндотелиальную миграцию лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов.

5. Секреторная – вырабатывает митогены, ингибиторы и факторы роста, цитокины, регулирующие кроветворение, пролиферацию и дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, привлекающие лейкоциты в очаг воспаления.

6. Сосудообразовательная – обеспечивает новообразование капилляров (ангиогенез) – как в эмбриональном развитии, так и при регенерации.

Перициты – клетки звездчатой формы, примыкающие снаружи к артериолам, венулам и капиллярам. Наиболее многочисленны в посткапиллярных венулах. Имеют собственную базальную мембрану, сливающуюся с базальной мембраной эндотелия, так что создается впечатление, что перицит заключен в расслоившуюся базальную мембрану эндотелия. Перицит охватывает стенку сосуда, что позволяет предположить их участие в регуляции просвета сосудов.

Перициты имеют дисковидное ядро с небольшими углублениями, содержат обычный набор органелл, мультивезикулярные тельца, микротрубочки и гликоген. В области, обращенной к стенке сосуда, содержат пузырьки. Около ядра и в отростках присутствуют сократительные белки, в т.ч. актин и миозин. Перициты покрыты базальной мембраной, но тесно связаны с эндотелиальной клеткой, т.к. базальная мембрана между ними может и отсутствовать. В этих местах выявлены щелевые и адгезионные контакты.

Функции перицитов четко не установлены. О конкретных функциях можно говорить с разной степенью вероятности.

1. Контрактильные свойства. Вероятно участие перицитов в регуляции просвета микрососуда.

2. Источник гладкомышечных клеток (ГМК). При заживлении ран и восстановлении сосудов перициты в течение 3-5 дней дифференцируются в ГМК.

3. 3.Влияние на эндотелиальные клетки. Перициты контролируют пролиферацию эндотелиальных клеток, как при нормальном росте сосудов, так и при их регенерации; модулируют функцию эндотелиальных клеток, регулируя транспорт макромолекул из капилляров в ткани.

4. Секреторная функция. Синтез компонентов базальной мембраны капилляра.

5. Участие в фагоцитозе.

Межклеточное вещество рыхлой волокнистой соединительной ткани состоит из волокон и основного аморфного вещества. Оно является продуктом деятельности клеток этой ткани, в первую очередь, фибробластов.

Функции межклеточного вещества рыхлой волокнистой соединительной ткани:

1. обеспечение архитектоники, физико-химических и механических свойств ткани;

2. участие в создании оптимального микроокружения для деятельности клеток;

3. объединение в единую систему всех клеток соединительной ткани и обеспечение передачи информации между ними;

4. воздействие на многочисленные функции различных клеток (пролиферацию, дифференцировку, подвижность, экспрессию рецепторов, синтетическую и секреторную активность, чувствительность к действию различных стимулирующих, ингибирующих и повреждающих факторов и т.п.). Этот эффект может осуществляться путем контактного воздействия компонентов межклеточного вещества на клетки, а также благодаря его способности накапливать и выделять факторы роста.

Коллагеновые волокна в составе разных видов соединительной ткани определяют их прочность. В рыхлой неоформленной волокнистой соединительной ткани они располагаются в различных направлениях в виде волнообразно изогнутых, спиралевидно скрученных, округлых или уплощенных в сечении тяжей толщиной 1-3 мкм и более. Длина их различна. Внутренняя структура коллагенового волокна определяется фибриллярным белком - коллагеном, который синтезируется на рибосомах гранулярной эндоплазматической сети фибробластов.

Рис. 3.11. I. Схема – уровни структурной организации коллагеновых волокон. II. Электронная микрофотография - коллагеновая фибрилла. Различают четыре уровня организации коллагеновых волокон: молекулы тропоколлагена (1), протофибриллы (2), фибриллы (3) и волокна (4).\

Коллагеновые волокна распространены не только в собственно соединительной ткани, но также в кости и хряще, где они соответственно называются оссеиновыми и хондриновыми. Эти волокна определяют прочность тканей на разрыв. В рыхлой неоформленной соединительной ткани они располагаются в различных направлениях в виде волнообразно изогнутых тяжей толщиной 1-3 мкм. Коллагеновые волокна состоят из пучков параллельно расположенных микрофибрилл толщиной в среднем 50-100 нм, связанных между собой гликозаминогликанами и протеогликанами. Их толщина зависит от числа фибрилл, которые имеют поперечную исчерченность (черные и светлые участки) с периодом повторяемости 64-70 нм. В пределах одного периода находятся вторичные полосы шириной 3-4 нм.

Коллагеновые структуры, входящие в состав соединительных тканей организма человека и животных, являются наиболее распространенными ее компонентами. Основным их компонентом является волокнистый белок - коллаген.

Коллаген - главный белок соединительной ткани, которая составляет свыше 50% веса организма человека и животных. Одновременно, по расчетам швейцарского ученого Ф. Верцара, на долю коллагена приходится около 30% общего количества белка в организме. Следовательно, коллаген в количественном отношении стоит среди белков на первом месте.

Расшифровка первичной структуры коллагена - важнейший этап развития этих знаний. Значение раскрытия структуры коллагена следует расценивать с учетом того большого интереса, который проявляют к коллагену в различных областях знаний. Он лежит в основе целых областей технологии. Все кожевенное производство - это по существу переработка коллагена. Денатурированный коллаген–желатин незаменимый компонент фото-киноматериалов. Из переработанного коллагена изготовляется множество материалов, применяющихся в ветеринарной и медицинской практике.

Экстрагированные из волокон молекулы коллагена имеют длину 200 нм и ширину 1,4нм. Они получили название тропоколлагена. Молекулы построены из трипластов - трех полипептидных цепочек, которые сливаются в единую спираль. Каждая цепочка содержит набор из трех аминокислот, закономерно повторяющихся на протяжении ее длины. Первая кислота в таком наборе может быть любой, вторая - пролин или лизин, третья – глицин.

Расположение аминокислот может варьировать, вследствие чего образуется четыре типа коллагена.

1 тип - в собственно соединительной ткани, кости, роговице глаза, склере, зубной связке и др.

2 тип - в гиалиновом и фиброзном хряще, стекловидном теле.

3 тип - в дерме кожи плода, кровеносных сосудах, в ретикулярных волокнах.

4 тип - в базальных мембранах, в капсуле хрусталика.

В 1973 году была расшифрована одна из полипептидных цепей коллагена, что представляется выдающимся событием. Коллаген значительно крупнее по молекулярному весу, чем другие изученные белки. Трудности работы по установлению структуры коллагена были обусловлены величиной молекулы и особой монотонностью его строения - частотой повторения аминокислотных остатков и их сочетаний, что сильно осложняло задачу исследований.

Молекулы коллагена имеют длину около 280 нм и ширину 1,4 нм. Они построены из триплетов - трех полипептидных цепочек, предшественника коллагена – проколлагена, свивающихся еще в клетке в единую спираль. Это первый , молекулярный, уровень организации коллагенового волокна. Проколлаген секретируется в межклеточное вещество.

Второй, надмолекулярный, уровень - внеклеточной организации коллагенового волокна - представляет агрегированные в длину и поперечно связанные с помощью водородных связей молекулы тропоколлагена, образующиеся путем отщепления концевых пептидов проколлагена. Сначала образуются протофибриллы, а 5-6 протофибрилл, скрепленных между собой боковыми связями, составляют микрофибриллы толщиной около 5 нм.

При участии гликозаминогликанов, также секретируемых фибробластами, формируется третий , фибриллярный и, уровень организации коллагенового волокна. Коллагеновые фибриллы представляют собой поперечно исчерченные структуры толщиной в среднем 20-100 нм. Период повторяемости темных и светлых участков 64-67 нм. Каждая молекула коллагена в параллельных рядах, как полагают, смещена относительно соседней цепи на четверть длины, что служит причиной чередования темных и светлых полос. В темных полосах под электронным микроскопом видны вторичные тонкие поперечные линии, обусловленные расположением полярных аминокислот в молекулах коллагена.

Четвертый , волоконный, уровень организации. Коллагеновое волокно, образующееся путем агрегации фибрилл, имеет толщину 1-10 мкм (в зависимости от топографии). В него входит различное количество фибрилл – от единичных до нескольких десятков. Волокна могут складываться в пучки толщиной до 150 мкм.

Коллагеновые волокна отличаются малой растяжимостью и большой прочностью на разрыв. В воде толщина сухожилия в результате набухания увеличивается на 50%, а в разбавленных кислотах и щелочах – в 10 раз, но при этом волокно укорачивается на 30%. Способность к набуханию больше выражена у молодых волокон. При термической обработке в воде коллагеновые волокна образуют клейкое вещество (греч. коllа - клей), что и дало название этим волокнам.

Ретикулярные (ретикулиновые, аргирофильные) волокна. Они встречаются в рыхлой и некоторых других видах соединительной ткани, в строме кроветворных органов, печени, внутренних оболочках сосудов. На препаратах импрегнированных серебром они располагаются в виде сети.

Рис. 3.12. Ретикулярные волокна в лимфатическом узле при импрегнации азотнокислым серебром. Волокна ветвятся, образуя тонкую сеть. ВV- кровеносный сосуд (х800).

Вопрос о природе ретикулярных волокон остается спорным. Большинство исследователей считают, что ретикулин - белок, составляющий основу этих волокон, представляет вещество близкое к коллагену, а импрегнационные и гистохимические отличия ретикулярных волокон от коллагеновых связаны со свойствами прошивающих волокна гликозаминогликанов. В отличие от коллагена и эластина ретикулин содержит больше серина, оксилизина и глютаминовой кислоты.

Эластические волокна. Эластические волокна придают ткани эластичность. Они менее прочны, чем коллагеновые на разрыв. В рыхлой соединительной ткани они образуют петлистую сеть, анастомозируя друг с другом. Толщина волокон от 0,2 до 1 мкм. В отличии от коллагеновых - они не имеют микроскопически видимых фибрилл и субмикроскопической поперечной исчерченности.

А

Б

Рис. 3.13. А - Эластические волокна в соединительной ткани (х320). Б - эластические волокна в стенке крупной артерии (х400), Е – тонкие эластические волокна, Сар - разветвленный капилляр, Р –плазматические клетки, С- коллагеновые волокна.

Основой эластических волокон является глобулярный гликопротеин - эластин, синтезируемый фибробластами и гладкими мышечными клетками (первый, молекулярный, уровень организации). Для эластина характерны большое содержание пролина и глицина и наличие двух производных аминокислот – десмозина и изодесмозина, которые участвуют в стабилизации молекулярной структуры эластина и придании ему способности к растяжению, эластичности. Молекулы эластина, имеющие глобулы диаметром 2,8 им, вне клетки соединяются в цепочки - эластиновые протофибриллы толщиной 3-3,5 нм (второй, надмолекулярный, уровень организации). Эластиновые протофибриллы в сочетании с гликопротеином (фибриллином) образуют микрофибриллы толщиной 8-19 нм (третий, фибриллярный, уровень организации). Четвертый уровень организации – волоконный. Наиболее зрелые эластические волокна содержат около 90% аморфного компонента эластических белков (эластина) в центре, а по периферии – микрофибриллы. В эластических волокнах в отличие от коллагеновых нет структур с поперечной исчерченностью на их протяжении.

Фибробласты - ведущие клетки рыхлой соединительной ткани, продуцирующие компоненты межклеточного вещества. Это отростчатые, веретенообразные или распластанные клетки размером около 20 мкм. В них хорошо развиты органеллы внутренней метаболической среды. Ядро фибробласта овальной формы, содержит равномерно распыленный хроматин и 2-3 ядрышка. Цитоплазма отчетливо подразделяется на интенсивно окрашенную эндоплазму и слабо окрашенную эктоплазму. Цитоплазма фибробластов (особенно молодых) базофильна. В ней выявляется хорошо развитая эндоплазматическая сеть с большим количеством рибосом, прикрепленных к мембранам в виде цепочек по 10-30 гранул. Такая ультраструктура гранулярной эндоплазматической сети характерна для клеток, активно синтезирующих белок "на экспорт". Имеются также многочисленные свободные рибосомы, хорошо развитый комплекс Гольджи. Митохондрии - крупные, количество их невелико. Цитохимическими методами показано наличие в цитоплазме фибробластов ферментов гликолиза и гидролитических ферментов лизосом (особенно - коллагеназы). Менее активны окислительные ферменты митохондрии.

Опорно-двигательная система клетки обеспечивает их подвижность, изменение формы, прикрепление к субстрату, механическое натяжение пленки, к которой клетка прикрепляется в культуре. На клеточной поверхности имеется много микроворсинок и пузырчатых выростов. Фибробласты во взвешенном состоянии в жидкой среде имеют шаровидную форму. Распластанным фибробласт становится после прилипания к твердой поверхности, по которой он передвигается за счет псевдоподий.

Основная функция фибробластов - синтез и секреция белков и гликозаминогликанов, идущих на формирование компонентов межклеточного вещества соединительной ткани, а также выработка и секреция колониестимулирующих факторов (грану-лоцитов, макрофагов). Фибробласты долгое время сохраняют способность к пролиферации. Фибробласты, закончившие цикл развития, называются фиброцитами. Это долгоживущие клетки. Цитоплазма клеток обедняется органеллами, клетка уплощается, пролиферативный потенциал падает. Однако клетка не теряет способность участвовать в регуляции обменных процессов в ткани.

Межклеточное вещество . Состоит из фибриллярного и основного (аморфного) компонентов. Методами гистоавторадиографии с введением меченых аминокислот (3Н-пролин, 3Н-глицин и др.) установлено, что в полисомах фибробластов происходит синтез молекул белка. Фибробласты одновременно могут синтезировать несколько типов специфических белков и гликозаминогликаны. Для синтеза белка коллагена имеет существенное значение наличие витамина С, при недостатке которого коллагеногенез резко тормозится. Интенсивнее идет синтез межклеточного вещества в условиях пониженной концентрации кислорода. Одновременно с синтезом коллагена фибробласт разрушает примерно 2/3 этого белка с помощью фермента коллагеназы, что препятствует преждевременному склерозированию ткани.

Синтезированные молекулы проколлагена выводятся на поверхность фибробластов путем экзоцитоза. При этом осуществляется переход белка из растворимой формы в нерастворимую - тропоколлаген. Объединение молекул тропоколлагена в надмолекулярные структуры - коллагеновые фибриллы - происходит в непосредственной близости от клеточной поверхности благодаря действию особых веществ, выделяемых клеткой. В частности, на поверхности фибробластов обнаружен белок - фибронектин, выполняющий адгезивную и другие функции. Последующие этапы фибриллогенеза происходят путем полимеризации и агрегации тропоколлагена на ранее образованных фибриллах. При этом созревание коллагеновых волокон может протекать и без прямой связи с фибробластами.
Гликозаминогликаны являются регуляторами коллагенообразования и входят в состав основного (аморфного) компонента межклеточного вещества.

Фибриллярный компонент межклеточного вещества рыхлой соединительной ткани включает три типа волокон - коллагеновые, эластические и ретикулярные. Они имеют сходный механизм образования, однако отличаются друг от друга по химическому составу, ультраструктуре и физическим свойствам. Белок коллаген идентифицируется по аминокислотному составу и последовательности расположения аминокислот в молекуле коллагена. В зависимости от вариации аминокислот в полипептидной цепи, иммунных свойств, молекулярной массы и др. различают 14 и более разновидностей коллагеновых белков, которые входят в состав соединительной ткани органов. Все они составляют 4 основных типа, или класса, коллагена.

Коллаген 1-го типа встречается в соединительной и костной тканях, а также в склере и роговице глаза; II-го типа - в хрящевых тканях; III-го типа - в стенке кровеносных сосудов, в соединительной ткани кожи плода; IV-ro типа - в базальных мембранах.