Молекулярные вакцины (анатоксины). Получение. Применение. Примеры. Научная электронная библиотека Что такое анатоксин столбнячный

Вакцины из отдельных антигенных компонентов микробной клетки

Как известно, микробная клетка содержит большое количество антигенов, но не все они одинаково индуцируют формирование иммунитета. В связи с этим решили добывать из микробной клетки те антигены, которые имеют наиболее выраженные иммуногенные свойства. Этот метод принадлежит Н. Ф. Гамалеи. Такими антигенами у микроорганизмов кишечно-тифозной группы является протеиновый глюцидоноидний комплекс (полный антиген Буквенная). Проектный антиген также относится к этой группе вакцин. Для получения антигенов пользуются различными химическими методами: экстрагирование трихлоруксусной кислотой, ферментативным преобразованиям, кислотным гидролизом и т.д. При введении комплексных антигенов в организм в чистом виде они быстро растворяются и не обеспечивают необходимого длительного иммунитета. Поэтому к ним обычно добавляют различные адсорбенты (аммонийные квасцы), которые при введении под кожу создают «депо» антигена и повышают их иммуногенную действие. Вакцины, состоящие из комплексных иммуногенных антигенов, называются химическими.
Анатоксины - продукты жизнедеятельности микроорганизма. Формирование иммунитета при ряде заболеваний (дифтерия, ботулизм и т.д.) имеет преимущественно антитоксическое характер. Поэтому, возникла идея о применении для профилактики этих болезней не микробов, а их эндотоксинов. Способы применения чистых токсинов даже в очень небольших количествах заканчивались неудачей, поскольку у привитых возникали очень тяжелые общие и особенно местные реакции, которые сопровождались некрозом кожи. Были попытки применить токсины, обезвреженные иммунной сывороткой (нейтральные смеси), но этот метод не получил широкого распространения, поскольку введенная сыворотка сенсибилизировала организм. Особенно удачным оказался способ, разработанный французским ученым Рамоном, который добавил к токсину формалин в небольших количествах и выдержал его при 37 0 С в течение 30-32 дней. В результате, был получен обезвреженный препарат, который сохранил свои иммунизирующие способности. Установлено, что механизм превращения токсина в анатоксин за двумя процессами: стабилизация лабильной молекулярной антигенной структуры токсина и блокированием его токсофорнных групп. Анатоксины выпускаются очищенными от балластных белков питательной среды, с добавлением декодирующих веществ (фосфат алюминия, гидрат окиси алюминия и др.). Анатоксины применяются для профилактики дифтерии, ботулизма.

Типы вакцин по количеству возбудителей

Моно вакцины - вакцины, приготовленные из одного возбудителя или антигена, с двумя антигенами - дивакцину, с тремя - тривакцина. Вакцины, содержащие антигены против нескольких инфекций, называются поливакцина, или комбинированными. Ассоциированные вакцины готовятся из антигенов различных бактерий и их токсинов. Например, вакцина, дифтерийно-коклюша, содержащей дифтерийный анатоксин и убитые бактерии коклюша, ассоциированная кишечная вакцина - столбнячный анатоксин, бактерий красного тифа и паротита. В тех случаях, когда вакцина состоит из разных штаммов одного и того же вида микроорганизмов, она называется поливалентной [Радчук, 1991].

Молекулярные вакцины – в них антиген находится в молекулярной форме или даже в виде фрагментов его молекул, определяющих специфичность т. е. в виде эпитопов, детерминант.

В процессе культивирования природных патогенных микробов можно получить протективный антиген, синтезируемый этими бактериями токсин затем превращается в анатоксин, сохраняющий специфическую антигенность и иммуногенность. Анатоксины являются одним из видов молекулярных вакцин. Анатоксины – препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные своих токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства.Получение : токсигенные бактерии выращивают на жидких средах, фильтруют с помощью бактериальных фильтров для удаления микробных тел, к фильтрату добавляют 0,4% формалина и выдерживают в термостате при 30-40t на 4 недели до полного исчезновения токсических свойств, проверяют на стерильность, токсигенность и иммуногенность. Эти препараты называются нативными анатоксинам, в настоящее время почти не используются, т. к. содержат большое количество балластных веществ, неблагоприятно влияющих на организм. Анатоксины подвергают физической и химической очистке, адсорбируют на адъювантах. Такие препараты называются адсорбированными высокоочищенными концентрированными анатоксинами.

Титрование анатоксинов в реакции фолликуляции производят по стандартной фолликулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество антитоксических единиц. 1 антигенная единица анатоксина обозначается Lf, это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флокуляции с 1 единицей дифтерийного анатоксина.

Анатоксины применяются для профилактики и реже, для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк). Так же анатоксины применяются для получения антитоксических сывороток путем гипериммунизации животных.

Примеры препаратов: АКДС, АДС, адсорбированный стафилококковый анатоксин, ботулинистический анатоксин, анатоксины из экзотоксинов возбудителей газовых инфекций

3 . Вирус кори. Таксономия. Характеристика. Лабора­торная диагностика. Специфическая профилактика.

Корь - острая инфекционная болезнь, ха­рактеризующаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз, а также пятнисто-папулезной сыпью на коже.

Таксономия. РНК-содержащий вирус. Семейства Paramyxoviridae. Род Morbillivirus.

Структура и антигенные свойства. Вирион окружён оболочкой с гликопротеиновыми шипами. Под оболочкой находится спиральный нуклеокапсид. Геном вируса - однонитевая, нефрагменти-рованная минус РНК. Имеются следующие основные белки: NP - нуклеокапсидный; М - матриксный, а также поверхностные гли-козилированные белки липопротеиновой обо­лочки - гемагглютинин (Н) и белок слияния (F), гемолизин. Вирус обладает гемагглютинирующей и гемолитической активнос­тью. Нейраминидаза отсутствует. Имеет общие антигены с вирусом чумы собак и крупного рогатого скота.

Культивирование. Культивируют на первично-трипсинизированных культурах клеток почек обезьян и человека, перевивае­мых культурах клеток HeLa, Vero. Возбудитель размножается с образованием гигантских мно­гоядерных клеток - симпластов; появляются цитоплазматические и внутриядерные вклю­чения. Белок F вызывает слияние клеток.

Резистентность. В окружающей среде нестоек, при комнатной температуре инактивируется через 3-4 ч. Быстро гибнет от солнечного света, УФ-лучей. Чувствителен к детергентам, дезинфектантам.

Восприимчивость животных. Корь воспро­изводится только на обезьянах, остальные животные маловосприимчивы.

Эпидемиология. Корь - антропонозная инфекция, распространена повсеместно. Восприимчивость человека к вирусу кори чрезвычайно высока. Болеют люди разного возраста, но чаще дети 4-5 лет.

Источник ин­фекции - больной человек.

Основной путь инфицирования - воздушно-капельный, ре­же - контактный. Наибольшая заражаемость происходит в продромальном периоде и в 1-й день появления сыпи. Через 5 дней после по­явления сыпи больной не заразен.

Патогенез. Возбудитель проникает через сли­зистые оболочки верхних дыхательных путей и глаз, откуда попадает в подслизистую оболоч­ку, лимфатические узлы. После репродукции он поступает в кровь (вирусемия) и поражает эндотелий кровеносных капилляров, обуслав­ливая тем самым появление сыпи. Развиваются отек и некротические изменения тканей.

Клиника. Инкубационный период 8-15 дней. Вначале отмечаются острые респираторные проявления (ринит, фарингит, конъюнктивит, фотофобия, температура тела 39С). Затем, на 3-4-й день, на слизистых оболочках и коже появляется пятнисто-папулезная сыпь, распространяющаяся сверху вниз: сначала на лице, затем на туловище и конечностях. За сут­ки до появления сыпи на слизистой оболочке щек появляются мелкие пятна, окруженные крас­ным ореолом. Заболевание длится 7-9 дней, сыпь исчезает, не оставляя следов.

Возбудитель вызывает аллергию, подавляет активность Т-лимфоцитов и иммунные реак­ции, что способствует появлению осложнений в виде пневмоний, воспаления среднего уха и др. Редко развиваются энцефалит и ПСПЭ.

Иммунитет. После перенесенной кори раз­вивается гуморальный стойкий пожизненный иммунитет. Повторные заболевания редки. Пассивный иммунитет, передаваемый плоду через плаценту в виде IgG, защищает новорож­денного в течение 6 месяцев после рождения.

Микробиологическая диагностика. Исследуют смыв с носоглотки, соскобы с элементов сыпи, кровь, мочу. Вирус кори можно обнаружить в патологическом материале и в зараженных культурах клеток с помощью РИФ, РТГА и реакции нейтрализации. Характерно наличие многоядерных клеток и антигенов возбудителя в них. Для серологической диагностики приме­няют РСК, РТГА и реакцию нейтрализации.

Лечение. Симптоматическое.

Специфическая профилактика. Активную специфическую профилактику кори прово­дят подкожным введением детям первого года жизни или живой коревой вакцины из аттенуированных штаммов, или ассоции­рованной вакцины (против кори, паротита, краснухи). В очагах кори ослабленным детям вводят нормальный иммуноглобулин чело­века. Препарат эффективен при введении не позднее 7-го дня инкубационного периода.

Билет 17.

1. Механизмы передачи генетического материала у бактерий.

Конъюгация бактерий состоит в переходе генети­ческого материала (ДНК) из клетки-донора («мужской») в клет­ку-реципиент («женскую») при контакте клеток между собой.

Мужская клетка содержит F-фактор, или половой фактор, который контролирует синтез так называемых половых пилей, или F-пилей. Клетки, не содержа­щие F-фактора, являются женскими; при получении F-фактора они превращаются в «мужские» и сами становятся донорами. F-фактор располагается в цитоплазме в виде кольцевой двунитчатой молекулы ДНК, т. е. является плазмидой. Молекула F-фак­тора значительно меньше хромосомы и содержит гены, контро­лирующие процесс конъюгации, в том числе синтез F-пилей. При конъюгации F-пили соединяют «мужскую» и «женскую» клетки, обеспечивая переход ДНК через конъюгационный мостик или F-пили. Клетки, содержащие F-фактор в цитоплазме, обозначаются F + ; они передают F-фактор клеткам, обозначае­мым F" («женским»), не утрачивая донорской способности, так как оставляют копии F-фактора. Если F-фактор включается в хромосому, то бактерии приобретают способность передавать фрагменты хромосомной ДНК и называются Hfr-клетками (от англ. high frequency of recombination - высокая частота реком­бинаций), т.е. бактериями с высокой частотой рекомбинаций. При конъюгации клеток Hfr и клеток F" хромосома разрывается и передается с определенного участка (начальной точки) в клет­ку F", продолжая реплицироваться. Перенос всей хромосомы может длиться до 100 мин.

Переносимая ДНК взаимодействует с ДНК реципиента - происходит гомологичная рекомбинация. Прерывая процесс конъ­югации бактерий, можно определять последовательность распо­ложения генов в хромосоме. Иногда F-фактор может при выхо­де из хромосомы захватывать небольшую ее часть, образуя так называемый замещенный фактор - F".

При конъюгации происходит только частичный перенос ге­нетического материала, поэтому ее не следует отождествлять пол­ностью с половым процессом у других организмов.

Трансдукция - передача ДНК от бактерии-донора к бактерии-реципиенту при участии бактериофага. Различают неспецифическую (общую) трансдукцию, при которой возможен перенос любого фрагмен­та ДНК донора, и специфическую - перенос определен­ного фрагмента ДНК донора только в определенные участки ДНК реципиента. Неспецифическая трансдукция обусловлена включе­нием ДНК донора в головку фага дополнительно к геному фага или вместо генома фага (дефектные фаги). Специфическая транс­дукция обусловлена замещением некоторых генов фага генами хромосомы клетки-донора. Фаговая ДНК, несущая фрагменты хромосомы клетки-донора, включается в строго определенные участки хромосомы клетки-реципиента. Таким образом, привно­сятся новые гены и ДНК фага в виде профага репродуцируется вместе с хромосомой, т.е. этот процесс сопровождается лизоге-нией. Если фрагмент ДНК, переносимый фагом, не вступает в рекомбинацию с хромосомой реципиента и не реплицируется, но с него считывается информация о синтезе соответствующего про­дукта, такая трансдукция называется абортивной.

Трансформация заключа­ется в том, что ДНК, выделенная из бактерий в свободной ра­створимой форме, передается бактерии-реципиенту. При транс­формации рекомбинация происходит, если ДНК бактерий род­ственны друг другу. В этом случае возможен обмен гомологич­ных участков собственной и проникшей извне ДНК. Впервые явление трансформации описал Ф. Гриффите (1928). Он вводил мышам живой невирулентный бескапсульный R-штамм пневмо­кокка и одновременно убитый вирулентный капсульный S-штамм пневмококка. Из крови погибших мышей был выделен вирулен­тный пневмококк, имеющий капсулу убитого S-штамма пнев­мококка. Таким образом, убитый S-штамм пневмококка передал наследственную способность капсулообразования R-штамму пнев­мококка. О. Эвери, К. Мак-Леод и М. Мак-Карти (1944) дока­зали, что трансформирующим агентом в этом случае является ДНК. Путем трансформации могут быть перенесены различные признаки: капсулообразование, устойчивость к антибиотикам, синтез ферментов.

Изучение бактериальной трансформации позволило установить роль ДНК как материального субстрата наследственности. При изучении генетической трансформации у бактерий были разра­ботаны методы экстракции и очистки ДНК, биохимические и биофизические методы ее анализа.

2 . Особенности противовирусного иммунитета.

Противовирусный иммунитет. Основой противовирусного иммунитета является клеточный иммунитет. Клетки-мишени, ин­фицированные вирусом, уничтожаются цитотоксическими лим­фоцитами, а также NK-клетками и фагоцитами, взаимодействую­щими с Fc-фрагментами антител, прикрепленных к вирусспецифическим белкам инфицированной клетки. Проти­вовирусные антитела способны нейтрализовать только внеклеточно расположенные вирусы, как и факторы неспецифическо­го иммунитета - сывороточные противовирусные ингибиторы. Такие вирусы, окруженные и блокированные белками организ­ма, поглощаются фагоцитами или выводятся с мочой, потом и др. (так называемый «выделительный иммунитет»). Интерфероны усиливают противовирусную резистентность, индуцируя в клет­ках синтез ферментов, подавляющих образование нуклеиновых кислот и белков вирусов. Кроме этого, интерфероны оказывают иммуномодулирующее действие, усиливают в клетках экспрес­сию антигенов главного комплекса гистосовместимости (МНС). Противовирусная защита слизистых оболочек обусловлена сек­реторными IgA, которые, взаимодействуя с вирусами, препятст­вуют их адгезии на эпителиоцитах.

3 . Возбудители шигеллеза. Таксономия. Характеристика. Микробиологическая диагностика. Специфическая профилактика и лечение.

Род Shigella включает 4 вида: S. dysenteriae - 12 сероваров, S.flexneri - 9 сероваров, S. boydii - 18 сероваров, S. sonnei - 1 серовар.

Морфология. Шигеллы представле­ны неподвижными палочками. Спор и капсул не образуют.

Культуральные свойства. Хорошо культи­вируются на простых питательных средах. На плотных средах образуют мелкие глад­кие, блестящие, полупрозрачные колонии; на жидких - диффузное помутнение. Жидкой средой обогащения является селенитовый бу­льон. У S. sonnei отмечена при росте на плот­ных средах S R-диссоциация.

Биохимическая активность: слабая; отсутствие газообразования при фермента­ции глюкозы, отсутствие продукции сероводорода, отсутствие ферментации лактозы.

Резистентность. Наиболее неустойчив во внешней среде вид S. dysenteriae. Шигеллы переносят высушивание, низкие темпе­ратуры, быстро погибают при нагревании. S. sonnei в молоке способны не только длительно пере­живать, но и размножаться. У S. dysenteriae отмечен переход в некультивируемую форму.

Антигенная структура. Соматический О-антиген, в зависи­мости от строения которого происходит их подразделение на серовары, a S. flexneri внут­ри сероваров подразделяется на подсеровары. S. sonnei обладает антигеном 1-й фазы, кото­рый является К-антигеном.

Факторы патогенности. Способность вызывать инвазию с пос­ледующим межклеточным распространением и размножением в эпителии слизистой толстого кишечника. Функци­онирование крупной плазмиды инвазии, кото­рая имеется у всех 4 видов шигелл. Плазмида инвазии детерминирует синтез белков, входящих в состав наружной мембраны, которые обеспечивают процесс ин­вазии слизистой. Продуцируют шига и шигаподобные белковые токсины. Эндотоксин защищает шигеллы от дейс­твия низких значений рН и желчи.

Эпидемиология: Заболевания - шигеллезы, антропонозы с фекально-оральным механизмом переда­чи. Заболевание, вызываемое S. dysenteriae, имеет контактно-бытовой путь передачи. S. flexneri - водный, a S. sonnei - алиментар­ный.

Патогенез и клиника: Инфекционные заболева­ния, характеризующиеся поражением толсто­го кишечника, с развитием колита и интокси­кацией.

Шигеллы взаимодействуют с эпителием слизистой тол­стой кишки. Прикрепляясь инвазинами к М-клеткам, шигеллы поглощаются макрофагами. Взаимодействие шигелл с макрофагами при­водит к их гибели, следствием чего является выделение ИЛ-1, который инициирует воспа­ление в подслизистой. При гибели шигелл происходит выделение шига токсинов, действие которых приводит к появлению крови в испражнениях.

Иммунитет. Секреторные IgA, пре­дотвращающие адгезию, и цитотоксическая антителозависимая активность лимфоцитов.

Анатоксины (anatoxinum от греч.- «an» - отрицание и toxo» - отравляю) представляют собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Метод получения анатоксина предложил в 1923 году крупнейший французский ученый Рамон (G. Ramon). При приготовлении анатоксинов культуры бактерий - возбудителей токсинемических инфекций, продуцирующих экзотоксины, выращивают в жидких питательных средах (реакторах большой емкости) для накопления токсина. Затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел. К фильтрату добавляют 0,3-0,4 % -формалина и помещают в термостат при температуре 37°-40°С н а 3-4 недели до полного исчезновения токсических свойств.

Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Такие препараты получили название нативных анатоксинов, т. к. они содержат большое количество веществ питательной среды, которые являются балластными и могут способствовать развитию нежелательных реакций организма при введении препарата.

Нативные анатоксины необходимо вводить в больших дозах из-за их невысокой удельной активности. Поэтому в настоящее время применяются преимущественно очищенные анатоксины, для чего нативные анатоксины подвергают обработке различными физическими и химическими методами (ионнообменной хромотографии, кислотному осаждению и др.), чтобы освободить от всех балластных веществ и сконцентрировать препарат в меньшем объеме. Однако уменьшение размеров частиц анатоксина сделало необходимым адсорбировать препарат на адъютантах.

Таким образом, применяющиеся анатоксины являются адсорбированными высокоочищенными концентрированными препаратам:"Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции - (Lf) или по реакции связывания анатоксинов, выражающуюся в единицах связывания- (ЕС). Титрование анатоксинов в реакции флоккуляции (по методу Рамона) производят по стандартной флоккулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество международных антитоксических единиц (ME, см. с. 23) в 1 мл. Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf - порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей дифтерийного антитоксина.

Определив дозу анатоксина, давшую инициальную (первичную) реакцию флоккуляции с одной антитоксической единицей сыворотки, рассчитывают количество Lf препарата в 1 мл. Антигенные свойства столбнячного анатоксина (и некоторых других) обозначают в единицах связывания (ЕС). Для определения ЕС необходимы:испытуемый препарат анатоксина, стандартная антитоксическая сыворотка (с содержанием 0,1 ME в 1 мл), опытная доза токсина (вытитрованная к 0,1 ME стандартной сыворотки), белые мыши.Реакцию связывания проводят следующим образом: в ряд пробирок с одинаковым объемом стандартной сыворотки добавляют различные разведения испытуемого анатоксина.Смесь для связывания выдерживают в термостате 45 минут,затем в каждую пробирку добавляют опытную дозу токсина и вновь оставляют в термостате на 45 минут.

После этого из каждой пробирки вводят смесь (сыворотки - анатоксина -токсина) 2-4 мышам и наблюдают за состоянием животных в течение 4 суток. Если весь анатоксин, добавленный к сыворотке, связался ею, то добавление токсина и последующее заражение мышей ведет к их гибели. При недостаточной дозе анатоксина для связывания всей сыворотки, добавленный токсин нейтрализуется сывороткой, и мыши остаются живыми. Для расчета ЕС в 1 мл определяемого анатоксина берется то разведение анатоксина, при котором происходит гибель 50% белых мышей на 4-е сутки. Это количество анатоксина содержит дозу, связывающую 0,1 ME сыворотки. Анатоксины применяются для профилактики и реже для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк) и некоторых заболеваний, вызванных стафилококками.



Анатоксины (anatoxinum от греч.- «an» - отрицание и toxo» - отравляю) представляют собой препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов, полностью лишенные т ксических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства. Метод получения анатоксина предложил в 1923 году крупнейший французский ученый Рамон (G. Ramon).При приготовлении анатоксинов культуры бактерий - возбудителей токсинемических инфекций, продуцирующих экзотоксины, выращивают в жидких питательных средах (реакто-

рах большой емкости) для накопления токсина. Затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел. К фильтрату добавляют 0,3-0,4 % -формалина и помещают в термостат при температуре 37°-40°С н а 3-4 недели до полного исчезновения токсических свойств. Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность. Такие препараты получили название нативных анатоксинов, т. к. они содержат большое количество веществ питательной среды, которые являются балластными и могут

способствовать развитию нежелательных реакций организма при введении препарата. Нативные анатоксины необходимо вводить в больших дозах из-за их невысокой удельной активности. Поэтому в настоящее время применяются преимущественно очищенные анатоксины, для чего нативные анатоксины подвергают обработке различными физическими и химическими методами (ионнообменной хромотографии, кислотному осаждению и др.), чтобы освободить от всех балластных веществ и сконцентрировать препарат в меньшем объеме. Однако уменьшение размеров частиц анатоксина сделало необходимым адсорбировать препарат на адъютантах

Таким образом, применяющиеся анатоксины являются адсорбированными высокоочищенными концентрированными препаратам:"Специфическую активность или силу анатоксина определяют в реакции флоккуляции в так называемых единицах флоккуляции- (Lf) или по реакции связывания анатоксинов, выражающуюся в единицах связывания- (ЕС). Титрование анатоксинов в реакции флоккуляции (по методу Рамона) производят по стандартной флоккулирующей антитоксической сыворотке, в которой известно количество международных антитоксических единиц (ME, см. с. 23) в 1 мл. Одна антигенная единица анатоксина обозначается Limes flocculationis (Lf - порог флоккуляции), это то количество анатоксина, которое вступает в реакцию флоккуляции с одной единицей дифтерийного антитоксина. Определив дозу анатоксина, давшую инициальную (первичную) реакцию флоккуляции с одной антитоксической единицей сыворотки, рассчитывают количество Lf препарата в 1 мл. Антигенные свойства столбнячного анатоксина (и некоторых других) обозначают в единицах связывания (ЕС). Для определения ЕС необходимы:испытуемый препарат анатоксина, стандартная антитоксическая сыворотка (с содержанием 0,1 ME в 1 мл), опытная доза токсина (вытитрованная к 0,1 ME стандартной сыворотки), белые мыши.Реакцию связывания проводят следующим образом: в ряд пробирок с одинаковым объемом стандартной сыворотки добавляют различные разведения испытуемого анатоксина.Смесь для связывания выдерживают в термостате 45 минут,затем в каждую пробирку добавляют опытную дозу токсина и вновь оставляют в термостате на 45 минут. После этого из каждой пробирки вводят смесь (сыворотки - анатоксина -токсина) 2-4 мышам и наблюдают за состоянием животных в течение 4 суток. Если весь анатоксин, добавленный к сыворотке, связался ею, то добавление токсина и последующее

заражение мышей ведет к их гибели. При недостаточной дозе анатоксина для связывания всей сыворотки, добавленный токсин нейтрализуется сывороткой, и мыши остаются живыми. Для расчета ЕС в 1 мл определяемого анатоксина берется то разведение анатоксина, при котором происходит гибель 50% белых мышей на 4-е сутки. Это количество анатоксина содержит дозу, связывающую 0,1 ME сыворотки. Анатоксины применяются для профилактики и реже для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая ган-

грена, ботулизм, столбняк) и некоторых заболеваний, вызванных стафилококками.

94. Антимикробные сыворотки (иммуноглобулины). Получение, приме­нение.

Антибактериальные сыворотки получают гипериммуннзацией лошадей соответствующими убитыми бактериями или антигенами и содержат антитела с агглютинирующими, литическими и опсонизирующими свойствами. Они не нашли широкого применения в силу их малой эффективности. Антибактериальные сыворотки относятся к нетитруемым препаратам, так как общепринятой единицы измерения их лечебной силы нe существует. Поэтому антибактериальные лечебные сыворотки дозируются в объемных единицах, непосредственно у постели больного, исходя из степени тяжести заболевания.для очистки и концентрации антибактериальных сывороток и некоторых антивирусных используют метод, основанный

на разделении белковых фракций нативных сывороток и выделении активных иммуноглобулинов этиловым спиртом при низкой температуре (метод водно-спиртового осаждения на холоду).Иммуноглобулины(гомологичные) , получаемые из крови человека, готовят двух видов - противокоревой (или нормальный) и иммуноглобулины направленного действия. Преимущество этих иммуноглобулинов перед гетерогенными в том, что они практически нереактогенны и циркулируют в организме болеее продолжительное время, в течение 30-40 дней.Извлекают иммуноглобулины из сыворотки крови человека путем фракционирования (по методу Кона) этиловым спиртом при температуре ниже нуля.Противокоревой (или нормальный) иммуноглобулин получают из донорской, плацентарной или абортной крови. Содержит антитела против вируса кори, а также против вирусов гриппа, гепатита, полиомиелита, возбудителей коклюша и не-

которых других вирусных и бактериальных инфекций. Препарат применяют для профилактики кори, инфекционного гепатита, коклюша, полиомиелита, менингококковой инфекции и др.для профилактики кори иммуноглобулины вводят всем детям старше 3 месяцев, бывших в контакте с больным и не привитым коревой вакциной. Иммуноглобулины вводят с профилактической целью всем детям до 6 лет, контактировавшим с больным коклюшем и не привитым против этой инфекции. Профилактика гепатита А иммуноглобулином проводятся

в предэпидемичсский период и в эпидемических очагах. Препарат в некоторых случаях оказывает защитное действие или чаще смягчает клиническое течение болезни. Очень важно правильное соблюдение дозировки иммуноглобулина (0,02 мл на 1 кг веса). Продолжительность профилактического действия препарата 3-6 месяцев. Иммуноглобулины направленного действия готовят из сыворотки крови людей-добровольцев, подвергшихся специальной иммунизации против определенной инфекции. Такие препараты содержат повышенные концентрации специфических антител и используются для лечебных целей. В настоящее время получают иммуноглобулины направленного действия против гриппа, бешенства, оспы, клещевого энцефалита, столбняка и стафилококковых инфекций.

95. Антитоксические сыворотки. Получение, очистка, титрование, при­менение.

Антитоксические сыворотки получают иммунизацией лошадей возрастающими дозами анатоксинов, а затем и соответствующими токсинами. Сыворотки подвергают очистке и концентрации методом «Диаферм-3»,контролю на безвредность, апирогенность, затем титруют т. е. определяют содержание антитоксинов в 1 мл препарата. Специфическая активность сывороток или количество антител измеряется с помощью специальных методов, основанных на способности сывороток in vitro и in vivo нейтрализовать соответствующие токсины и

выражается в международных антитоксических единицах (ME), принятых ВОЗ. За 1 ME принимается

то минимальное количество сыворотки, которое способно нейтрализовать определенную дозу токсина, выражающуюся в стандартных единицах, обозначаемых как смертельные, некротические или реактивные дозы в зависимости от вида токсина и способа титрования.Титрование антитоксических сывороток может проводиться тремя методами - методами Эрлиха, Рёмера, Района.Титрование сывороток по методу Района

осуществляется с помощью реакции флоккуляции по известному анатоксину или токсину, одну Lf (Limes flocculationis -порог флоккуляции) которых нейтрализует одна единица дифтерийного антитоксина. Первичная или инициальная реакция флоккуляции наступает при соответствии количества антигенных единиц анатоксина количеству антитоксинов в исследуемой сыворотке. Исходя из результатов первичной реакции флоккуляции и ведется расчет антитоксических единиц в 1 мл испытуемой сыворотки. Однако метод Рамона является

только ориентировочным. Метод Эрлиха . Перед титрованием сывороток по методу Эрлиха проводят определение условной смертельной (опытной) дозы токсина Lt (Limes tod). Lt определяется с помощью стандартной антитоксической сыворотки, к определенному количеству которой добавляют различные объемы

токсина и после выдерживания смеси при комнатной температуре (в течение 45 минут) вводят белым.мышам или морским свинкам. Затем наблюдают за животными четверо суток. За опытную дозу токсина (Lt) принимается то количество токсина, которое в смеси с 1 ME стандартной сыворотки вызывает гибель 50% взятых в опыт животных. На втором этапе титрования к различным разведениям испытуемой сыворотки добавляют опытную дозу токсина, смесь также выдерживают и вводят животным. По получаемым результатам производят расчет титра испытуемой антитоксической сыворотки. Метод Рёмера . Титрование антитоксических сывороток

Препараты, полученные из бактериальных экзотоксинов , полностью лишенные токсических свойств, но сохранившие антигенные и иммуногенные свойства.

Метод получения анатоксина предложил в 1923 году крупнейший французский ученый Рамон (G. Ramon).При приготовлении анатоксинов культуры бактерий выращивают в жидких питательных средах для накопления токсина. Затем фильтруют через бактериальные фильтры для удаления микробных тел.

К фильтрату добавляют 0,3-0,4 % -формалина и помещают в термостат при температуре 37°-40°С на 3-4 недели до полного исчезновения токсических свойств. Полученный анатоксин проверяют на стерильность, безвредность и иммуногенность.

Такие препараты получили название нативных анатоксинов, т. к. они содержат большое количество веществ питательной среды , которые являются балластными и могут способствовать развитию нежелательных реакций организма при введении препарата. Нативные анатоксины необходимо вводить в больших дозах из-за их невысокой удельной активности.

Очищенные анатоксины - нативные анатоксины подвергают обработке различными физическими и химическими методами (ионнообменной хромотографии, кислотному осаждению и др.), Однако уменьшение размеров частиц анатоксина сделало необходимым адсорбировать препарат на адъютантах.

Анатоксины применяются для профилактики и реже для лечения токсинемических инфекций (дифтерия, газовая гангрена, ботулизм, столбняк) и некоторых заболеваний, вызванных стафилококками.

1. Дифтерийный анатоксин адсорбированный - фильтрат токсигенного штамма дифтерийной палочки «Парк Вильяме 8», обезвреженный по методу Рамона.

Применяется для профилактики дифтерии в виде моноанатоксина, чаще в составе АДС или АКДС.

2. Столбнячный анатоксин сорбированный - препарат, полученный из фильтрата бульонной культуры столбнячной палочки, обезвреженный по методу Рамона при 40°С.

Применяется в составе АКДС для иммунизации против столбняка детей в возрасте от 6 месяцев до 5 лет с последующими ревакцинациями.

3. Дифтерийно-столбнячный анатоксин адсорбированный (АДС) АДС используют вместо вакцины АКДС при отсутствии необходимости иммунизации против коклюша.

Сыворотки

Для специфического лечения и экстренной специфической профилактики ряда инфекционных болезней применяют сыворотки искусственно иммунизированных животных (в основном лошадей).

1. Лечебные сыворотки

Преимущество :

Быстрота создаваемого пассивного иммунитета. Введенные иммуноглобулины способны немедленно нейтрализовать патогенные микроорганизмы и токсические продукты их жизнедеятельности.

Недостатки :

Кратковременность обусловливаемого ими пассивного иммунитета. Быстрое выведение (через 1-2 недели) иммуноглобулинов из организма связано с естественным процессом распада белков и действием образовавшихся антител к введенным белкам - иммуноглобулинам.

Может вызвать побочные реакции - анафилактический шок или сывороточную болезнь .

При введении гомологичной сыворотки (сыворотки человека) антитела циркулируют в организме в течение 4-5 недель, обусловливая более длительное состояние невосприимчивости , связанное с тем, что происходит медленный процесс разрушения введенных белков.

Частота развития сывороточной болезни зависит от количества введенного чужеродного белка. Для устранения этого осложнения сыворотки подвергают очистке от балластных белков.